Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization
Summary
De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.
Abstract
Organoïden bieden zelforganiserende, driedimensionale weefselstructuren die fysiologische processen samenvatten in het gemak van een gerecht. De murine borstklier bestaat uit twee verschillende epitheelcelcompartimenten, die verschillende functies vervullen: de buitenste, contractiele myoepitheelcompartiment en het binnenste, secretoire luminaircompartiment. Hier beschrijven we een methode waarmee de cellen bestaande uit deze compartimenten worden geïsoleerd en vervolgens gecombineerd om hun individuele afstamming bijdragen aan borstklier morfogenese en differentiatie te onderzoeken. De methode is eenvoudig en efficiënt en vereist geen geavanceerde scheidingstechnologieën zoals fluorescentie geactiveerde celhet sorteren. In plaats daarvan oogsten en verwerken we het weefsel enzymatisch, zaaien we het epitheel op aanhangende weefselkweekgerechten en gebruiken we differentiële trypsinisatie om myoepitheel te scheiden van luminale cellen met ~90% zuiverheid. De cellen worden vervolgens verguld in een extracellulaire matrix waar ze zich organiseren in tweelaagse, driedimensionale (3D) organoïden die kunnen worden gedifferentieerd om melk te produceren na 10 dagen in de cultuur. Om de effecten van genetische mutaties te testen, kunnen cellen worden geoogst uit wilde type of genetisch gemanipuleerde muismodellen, of ze kunnen genetisch worden gemanipuleerd voorafgaand aan de 3D-cultuur. Deze techniek kan worden gebruikt om mozaïekorganoïden te genereren die het mogelijk maken om de genfunctie specifiek in het luminale of myoepitheelcompartiment te onderzoeken.
Introduction
De borstklier (MG) is een boomachtige, buisvormige epitheelstructuur ingebed in een adipocyte rijke stroma. Het tweelaagse buisepitheel bestaat uit een buitenste, basale laag contractiele, myoepitheelcellen (MyoECs) en een binnenste laag van luminale, secretoire epitheelcellen (LEC’s), die een centraal lumenomringen 1. Tijdens de lactatie wanneer de buitenste MyoECs contract om melk te persen uit de binnenste alveolar LECs, de MG ondergaat tal van veranderingen die onder de controle van groeifactoren (bijvoorbeeld, EGF en FGF) en hormonen (bijvoorbeeld progesteron, insuline, en prolactine). Deze veranderingen veroorzaken de differentiatie van gespecialiseerde structuren, longblaasjes, die melk synthetiseren en afscheiden tijdens lactatie1. De borstepithelia kan experimenteel worden gemanipuleerd met behulp van technieken waarbij ofwel epitheliale weefselfragmenten, cellen, of zelfs een enkele basale cel worden getransplanteerd in gastheer borstvetpads, vooraf gerooid van endogene borstparenchyma, en mag uitgroeien tot een volledige, functionele epitheelboom2,3,4,5. Transplantatie is een krachtige techniek, maar het is tijdrovend en onmogelijk als een mutatie resulteert in vroege embryonale letaliteit (voorafgaand aan E14) die de redding van transplanteerbare borstanlage voorkomt. Verder willen onderzoekers vaak onderzoek doen naar de rollen van de twee verschillende compartimenten, die zijn afgeleid van stamgebonden voorlopercellen. Hoewel Cre-lox-technologie differentiële genetische manipulatie van MyoECs en LEC’s mogelijk maakt, is dit ook een tijdrovende en dure onderneming. Sinds de jaren vijftig hebben onderzoekers dus in vitro borstorganoïden gebruikt als een relatief eenvoudige en efficiënte manier om vragen over de structuur van het borstweefsel en functie6,7aan te pakken.
In vroege protocollen die de isolatie en de cultuur van primaire borstepitheelcellen beschrijven, vonden de onderzoekers dat een demembraanmatrijmat (BME), die uit een plasmastolsel en kippenembryouittreksel wordt samengesteld, voor mg fragmenten nodig was die op een schotel worden gekweekt6. In de volgende decennia werden extracellulaire matrices (EPM’s, collageen en geleiachtige eiwitmatrix, uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoomcellen) ontwikkeld om de 3D-cultuur te vergemakkelijken en de in vivo omgeving7,8,,9,10beter na te bootsen. Kweekcellen in 3D-matrices onthulddoor meerdere criteria (morfologie, genexpressie en hormoonresponsiviteit) dat een dergelijke micro-omgeving betere modellen in vivo fysiologische processen9,10,11,12. Onderzoek met primaire murinecellen identificeerde belangrijke groeifactoren en morfogenen die nodig zijn voor het uitgebreide onderhoud en de differentiatie van organoïden13. Deze studies hebben het podium voor het protocol hier gepresenteerd, en voor de cultuur van menselijke borstcellen als 3D-organoïden, dat is nu een modern klinisch instrument, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen en drugs testen op patiënt monsters14. Over het algemeen benadrukt organoïde kweekde de zelforganisatiecapaciteiten van primaire cellen en hun bijdragen aan morfogenese en differentiatie.
Hier gepresenteerd is een protocol om de cultuur murine epithelia die kan worden gedifferentieerd in melkproducerende acini. Een differentiële trypsinisatietechniek wordt gebruikt om de MyoECs en LEC’s te isoleren die de twee verschillende MG-celcompartimenten omvatten. Deze gescheiden celfracties kunnen dan genetisch worden gemanipuleerd om de genfunctie te overexpresseren of neer te halen. Omdat afstamming-intrinsieke, zelforganisatie is een aangeboren eigenschap van borstepitheelcellen15,16,17, recombining deze celfracties kunnen onderzoekers om tweelaagse, mozaïek organoïden te genereren. We beginnen met enzymatisch verteren van het vetweefsel, en vervolgens het uitbroeden van de borstfragmenten op een weefsel kweekschotel voor 24 uur (Figuur 1). De weefselfragmenten vestigen zich op polystyreengerechten als tweelaagse fragmenten met hun in vivo organisatie: buitenste myoepitheellaag rond binnenarmatuurlagen. Deze cellulaire organisatie zorgt voor de isolatie van de buitenste MyoECs door trypsin-EDTA (0,05%) behandeling voor 3-6 min gevolgd door een tweede ronde trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die de resterende binnenste LEC’s losmaakt(figuur 2). Zo worden deze celtypen met verschillende trypsinegevoeligheid geïsoleerd en vervolgens gemengd en verguld in ECM(figuur 3). De cellen ondergaan zelforganisatie om tweelagige bollen te vormen, bestaande uit een buitenste laag MyoECs rond innerlijke LEC’s. Lumenvorming treedt op als de cellen groeien in een medium met een cocktail van groeifactoren (zie recepten voor Growth Medium)13. Na 5 dagen kunnen organoïden worden onderscheiden in melkproducerende acini door over te schakelen op Alveologenesis Medium (zie recepten en figuur 3F)en nog 5 dagen geïncubeerd. Als alternatief zullen organoïden blijven uitbreiden en vertakken in Growth Medium gedurende ten minste 10 dagen. Organoïden kunnen worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie(figuur 3D-F)of vrijgegeven uit de ECM met behulp van een hersteloplossing (zie Tabel met materialen)en geanalyseerd via andere methoden (bijvoorbeeld immunoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een methode gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe onderzoekers 3D-organoïde culturen kunnen genereren met behulp van primaire MG-cellen. Het verschil tussen deze en andere protocollen is dat we een methode om de twee, verschillende MG celcompartimenten te scheiden detail: de buitenste basale MyoECs en innerlijke LECs. Onze methode maakt gebruik van een twee-staps trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die we differentiële trypsinisatienoemen 19. Deze procedure stelt onderzoekers in staa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Ben Abrams voor technische bijstand en kernondersteuning van de University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wij danken Susan Strome en Bill Saxton voor het gebruik van hun Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies aan UCSC van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma (S.R.), van het NIH (NIH GM058903) voor het initiatief voor het maximaliseren van de ontwikkeling van studenten (H.M.) en van de National Science Foundation voor een graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) en door een beurs (A18-0370) van het UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
