Brystkjertelen er en bilayered struktur, bestående av ytre myoepitelog indre luminal epitelceller. Presentert er en protokoll for å forberede organoider ved hjelp av differensial trypsinisering. Denne effektive metoden gjør det mulig for forskere å separat manipulere disse to celletypene for å utforske spørsmål om deres roller i brystkjertelform og funksjon.
Organoider tilbyr selvorganiserende, tredimensjonale vevsstrukturer som rekapitulerer fysiologiske prosesser i bekvemmeligheten av en tallerken. Murine brystkjertelen består av to forskjellige epitelcellerom, som serverer forskjellige funksjoner: det ytre, kontraktile myoepithelialrommet og det indre, sekretoriske armaturrommet. Her beskriver vi en metode der cellene som består av disse rommene er isolert og deretter kombinert for å undersøke deres individuelle avstamningbidrag til brystkjertelen morfoogenese og differensiering. Metoden er enkel og effektiv og krever ikke sofistikertseparasjonsteknologier som fluorescensaktivert cellesortering. I stedet høster vi og enzymatically fordøye vevet, frø epitelet på tilhengervev sover, og deretter bruke differensial trypsinization å skille myoepithelial fra luminal celler med ~ 90% renhet. Cellene blir deretter belagt i en ekstracellulær matrise hvor de organiserer seg i bilayered, tredimensjonale (3D) organoider som kan differensieres for å produsere melk etter 10 dager i kultur. For å teste effekten av genetiske mutasjoner, celler kan høstes fra vill type eller genmodifiserte musemodeller, eller de kan genetisk manipuleres før 3D kultur. Denne teknikken kan brukes til å generere mosaikkorganoider som tillater undersøkelse av genfunksjon spesielt i luminal eller myoepithelial rommet.
Brystkjertelen (MG) er en trelignende, rørformet epitelstruktur innebygd i en adipocyte rik stroma. Det tolagsductal epitelet består av et ytre, basallag av kontraktile, myoepitelceller (MyoECs) og et indre lag av luminale, sekretoriske epitelceller (LECer), som omkranser en sentral lumen1. Under amming når de ytre MyoECs kontrakt for å presse melk fra indre alveolære LECer, MG gjennomgår mange endringer som er under kontroll av vekstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse endringene forårsaker differensiering av spesialiserte strukturer, alveoler, som syntetiserer og utskiller melk under amming1. Mammary epitelkan bli eksperimentelt manipulert ved hjelp av teknikker der enten epitelvev fragmenter, celler, eller til og med en enkelt basal celle er transplantert inn i verten pattedyr fett pads, precleared av endogene bryst parenchyma, og lov til å vokse ut for å rekonstituere en hel, funksjonell epithelial treet2,3,4,5.5 Transplantasjon er en kraftig teknikk, men det er tidkrevende og umulig hvis en mutasjon resulterer i tidlig embryonal dødelighet (før E14) som forhindrer redning av transplanterbare pattedyranlage. Videre ønsker etterforskerne ofte å undersøke rollene til de to forskjellige rommene, som er avledet fra avstamningsbegrensede stamceller. Mens Cre-lox-teknologi tillater differensial genetisk manipulering av MyoECs og LECer, er dette også et tidkrevende og dyrt foretak. Dermed, siden 1950-tallet, har forskerne brukt in vitro mammary organoider som en relativt enkel og effektiv måte å løse spørsmål om brystvevstruktur og funksjon6,7.
I tidlige protokoller som beskriver isolasjon og kultur av primære pattedyr epitelceller, fant forskerne at en kjeller membran matrise (BME), bestående av en plasmablodpropp og kylling embryo ekstrakt, var nødvendig for MG fragmenter dyrket på en tallerken6. I de følgende tiårene ble ekstracellulære matriser (EcMs, kollagen og gelélignende proteinmatrise utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomceller) utviklet for å lette 3D-kulturen og bedre etterligne in vivo-miljøet7,8,9,10. Culturing celler i 3D matriser avslørt av flere kriterier (morfologi, genuttrykk, og hormon respons) at et slikt mikromiljø bedre modeller i vivo fysiologiske prosesser9,,10,11,12. Forskning ved hjelp av primære murine celler identifisert viktige vekstfaktorer og morfogener nødvendig for utvidet vedlikehold og differensiering av organoider13. Disse studiene har satt scenen for protokollen presentert her, og for kulturen av menneskelige brystceller som 3D organoider, som nå er et moderne klinisk verktøy, slik at for narkotika oppdagelse og narkotikatesting på pasientprøver14. Samlet sett fremhever organoid kuling selvorganisasjonens kapasiteter av primærceller og deres bidrag til morfogenese og differensiering.
Presentert her er en protokoll til kultur murine epitel som kan differensieres til melkeproduserende acini. En differensialtrypsiniseringsteknikk brukes til å isolere MyoECs og LECer som utgjør de to forskjellige MG-cellerommene. Disse separerte cellefraksjonene kan deretter manipuleres genetisk til overexpress eller knockdown genfunksjon. Fordi avstamning-iboende, selv-organisasjon er en medfødt egenskap av pattedyr epitelceller15,16,17, rekombinere disse celle fraksjoner tillater forskere å generere bilayered, mosaikk organoider. Vi begynner med enzymatically fordøye fettvevet, og deretter inkubere brystfragmentene på en vevkulturrett i 24 timer (Figur 1). Vevsfragmentene legger seg på polystyrenretter som bilayered fragmenter med sin in vivo organisasjon: ytre myoepithelial lag rundt indre luminale lag. Denne mobilorganisasjonen gjør det mulig å isolere de ytre MyoECs ved å trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min etterfulgt av en andre runde med trypsin-EDTA (0,05%) behandling som løsner de resterende indre LECene (figur 2). Dermed isoleres disse celletypene med forskjellig trypsinfølsomhet og kan deretter blandes og lagres i ECM (figur 3). Cellene gjennomgår selvorganisering for å danne tolagskuler, bestående av et ytre lag av MyoECs rundt indre LECer. Lumen formasjon oppstår som cellene vokser i et medium som inneholder en cocktail av vekstfaktorer (se oppskrifter for VekstMedium)13. Etter 5 dager kan organoider differensieres til melkeproduserende acini ved å bytte til Alveologenesis Medium (se oppskrifter og figur 3F)og inkuberes i ytterligere 5 dager. Alternativt vil organoider fortsette å ekspandere og gren i Vekstmedium i minst 10 dager. Organoider kan analyseres ved hjelp av immunfluorescens (Figur 3D-F) eller frigjøres fra ECM ved hjelp av en gjenopprettingsløsning (se materialtabellen) og analyseres via andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).
Her presenteres en metode som beskriver hvordan forskere kan generere 3D organoid kulturer ved hjelp av primære MG-celler. Forskjellen mellom dette og andre protokoller er at vi beskriver en metode for å skille de to, distinkte MG-cellerommene: de ytre basal myoecs og indre LECer. Vår metode benytter en to-trinns trypsin-EDTA (0,05%) behandling som vi kaller differensial trypsinization19. Denne prosedyren gjør det mulig for forskere å isolere MyoECs og LECer uten å bruke sofistikert flyt cyt…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ben Abrams for teknisk assistanse og kjernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologien til stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for bruken av deres Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gjennom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet for å maksimere studentutvikling (H.M.) og fra fra National Science Foundation for et stipendiatstipend (O.C. DGE 1339067) og ved et stipend (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |