JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

Published: April 27, 2020
doi:
10.3791/60829
, , , , , , ,
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering,Technion – Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology,Technion – Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology,Technion – Israel Institute of Technology

Summary

Denne protokol beskriver metode, materialer, udstyr og trin til bottom-up forberedelse af RNA og proteinproducerende syntetiske celler. Den indre vandige rum af de syntetiske celler indeholdt S30 bakterielle lysat indkapslet i en lipid tolags (dvs. stabile liposomer), ved hjælp af en vand-i-olie emulsion overførsel metode.

Abstract

Bottom-up-samlingsmetoden til konstruktion af syntetiske celler er et effektivt værktøj til at isolere og undersøge cellulære processer i et celleefterlignende miljø. Desuden har udviklingen af cellefrie ekspressionssystemer vist evnen til at rekonstituere proteinproduktion, transskription og oversættelsesprocesser (DNA→RNA→protein) på en kontrolleret måde, der udnytter syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af en celle-frit udtryk system, herunder produktion af en potent bakteriel lysat og indkapsle dette lysat inde kolesterol-rige lipid-baserede kæmpe unilamellar vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), til at danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metoderne til fremstilling af komponenterne i de syntetiske celler, herunder produktion af aktive bakterielysater, efterfulgt af en detaljeret trinvis forberedelse af de syntetiske celler baseret på en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode. Disse letter produktionen af millioner af syntetiske celler på en enkel og overkommelig måde med en høj alsidighed til at producere forskellige typer af proteiner. De opnåede syntetiske celler kan bruges til at undersøge protein/RNA-produktion og -aktivitet i et isoleret miljø, i styret udvikling, og også som en kontrolleret lægemiddelleveringsplatform til on-demand produktion af terapeutiske proteiner inde i kroppen.

Introduction

Syntetiske celler er kunstige celle-lignende partikler, efterligne en eller flere funktioner i en levende celle, såsom evnen til at opdele, danne membran interaktioner, og syntetisere proteiner baseret på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler, der omslutter cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) har høj modularitet på grund af deres evne til at producere forskellige proteiner og RNA-sekvenser efter ændringer i DNA-skabelonen. Cfps-systemer, der udgør et attraktivt alternativ til de nuværende tilgange til proteinproduktion, er baseret på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og omfatter alle de transskriptions- og oversættelsesmaskiner, der kræves til proteinsyntese, såsom ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-phosphoglycerat og adenintrifosfat)4,5,6,7,8,9. Indkapslingen af et CFPS-system inde i lipidvesikler muliggør enkel og effektiv produktion af proteiner uden at være afhængig af en levende celle10. Desuden, denne platform tillader syntese af peptider, der kan nedbrydes inde i naturlige celler, produktion af proteiner, der er giftige for levende celler, og ændre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler er blevet anvendt som model til forskningsformål , der undersøger de minimale cellekomponenter , der er nødvendige for at muliggøre celleliv fra et evolutionært perspektiv1,13. Syntetiske celler er også blevet anvendt til at opbygge og implementere genetiske kredsløb og som modeller for styret evolution14,15,16. Andre undersøgelser har fokuseret på evne til syntetiske celler til at efterligne den biologiske aktivitet af naturlige celler, der sigter mod at erstatte beskadigede naturlige celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Desuden illustrerer disse cfps’ evne til at producere en række terapeutiske proteiner, at den ser ud til at kunne indarbejdes i klinisk anvendelse18.

Her beskriver vi en bottom-up lab-skala protokol (Figur 1) til produktion af RNA og proteinproducerende syntetiske celler baseret på et CFPS-system indkapslet i en lipidvesikel. Dette viser den potentielle brug af syntetiske celleplatforme som nye lægemiddelfremføringssystemer til onsite-produktion af et terapeutisk proteinlægemiddel in vivo19. Tidligere undersøgelser har undersøgt optimeringen af den fælles fiskeripolitiks reaktion og cellelysatforberedelsesprocesserne4,8,20. Desuden er der anvendt flere teknikker til cellestørrelse liposom præparat, såsom mikrofluidiske og polymer-baserede dråbe stabiliseringsmetoder21,22,23, som også adskiller sig i liposomer ‘lipid sammensætning24,25,26. I den præsenterede protokol fremstilles syntetiske celler ved hjælp af en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode , og indkapslingsprocessen udføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,10,24,27,28. Disse milde betingelser har vist sig at være gunstige for at bevare den biofunktionelle integritet af de molekylære maskiner, nemlig ribosomer og proteiner27,29,30. Partiklernes lipidsammensætning består af både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). Den første findes i alle pattedyr cellemembraner og er afgørende for stabilitet, stivhed og permeabilitet reduktion af membranen, og sidstnævnte efterligner pattedyr fosfolipid sammensætning11,13. Den cellulære transskription og oversættelse molekylære maskiner udvindes fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som omdannes med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase at øge CFPS potens og proteinsyntese. Dette system er blevet anvendt til fremstilling af diagnostiske og terapeutiske proteiner med molekylvægt på op til 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokol giver en enkel og effektiv metode til produktion af det syntetiske cellesystem, som kan behandle en bred vifte af grundlæggende spørgsmål i forbindelse med proteinsyntese i naturen og kan også anvendes til lægemiddellevering applikationer.

Protocol

BEMÆRK: Illustration af hele produktionsprotokollen for syntetiske celler er vist i figur 1. Ifølge brugerens behov kan proteinekspressionen (afsnit 3.2) og de syntetiske celledannelsesdele (afsnit 4) dele af protokollen også udføres uafhængigt (med visse tilpasninger). 1. Forberedelse af S30-T7 lysate Stribeplade E. coli BL21(DE3) bakterier omdannet med T7 RNA polymerase udtrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plade suppleret med 50 μg/m…

Representative Results

Vi præsenterer en protokol til fremstilling af syntetiske celler ved at indkapsle et S30-T7 CFPS-system baseret på BL21 E. coli inde i lipidvesikler. En skematisk beskrivelse af forberedelsesprocessen , der indeholder et billede af hvert trin, præsenteres i figur 2. Succesen af den syntetiske celleforberedelsesproces afhænger af, om hvert trin fungerer korrekt, og at de udføres af forskellige parametre. Protokollen bør tilpasses, så den tager højde for produktionen af et bes…

Discussion

Denne protokol indfører en enkel og økonomisk overkommelig metode til produktion af store mængder proteinproducerende syntetiske celler. Udbyttet af aktive celler er afhængig af omhyggelig og præcis udførelse af protokollen med vægt på flere kritiske trin. I lysatpræparatdelen af denne metode er det vigtigt at nå den relevante bakterietæthed før cellelysis for at opnå en tilstrækkelig mængde proteiner i bakterielysatet. For det andet bør lysisprocessen udføres ved 4 °C, og lysatet nedfryses hurtigt med …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af ERC-STG-2015-680242.

Forfatterne anerkender også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Tværfagligt Center for Biovidenskab og Teknik; det israelske økonomiministerium for et Kamin Grant (52752); Det Israelske Ministerium for Videnskabsteknologi og Rum – Chefforskerens Kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske fond for videnskabelig forskning og udvikling af et GIF-tilskud (I-2328-1139.10/2012); Den Europæiske Unions FP-7 IRG-program for et karriereintegrationsstipendium (908049) Phospholipid Forskningscenter Grant; en Rosenblatt Foundation for kræftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkender Alon og Taub Stipendier. O. Adir anerkender Sherman og Gutwirth stipendier. G. Chen anerkender Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkender baronesse Ariane de Rothschild Kvinder Ph.d.-program fra Rothschild Caesarea Foundation.

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)  NEB C2527 E.coli BL21 (DE3).
pAR1219 Sigma T2076 TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin Sigma A9518 Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
15 g/L Agar agar purified Merck 1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
12 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous Bio-Lab 7120501
2.32 g/L K2HPO4 Spectrum chemical P1383
12.54 g/L KH2PO4 Spectrum chemical P1380
 50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  INALCO INA-1758-1400 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)  TCI D1071 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 Sigma T1503 S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate Merck 1.05819.0250
60 mM potassium acetate Carlo Erba 470147
1 mM DTT TCI D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol Sigma M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks Thermo Scientific 50-154-2846 2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles KIMAX-KIMBLE 25630 2 flasks
Floor incubator shaker MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor.
Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer AVESTIN EmulsiFlex-C3 Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer SO-LOW U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer TECAN IN-MNANO Infinite M200 pro
96-well transparent plate Thermo Scientific 167008
Sterilized graduated cylinder Corning
Sterilized centrifuge tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips Corning Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
Small liquid nitrogen tank NALGENE 4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Lipoid 556400 Powder
Cholesterol Sigma C8667 Powder
Chloroform Bio-Lab 3082301
Mineral oil Sigma M5904 Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Heating block TECHNE FDB03AD Pre-heated to 80 °C.
Should enable controlled temperature. 
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232 For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap CSI Analytical Innovations C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES Spectrum H1089 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH) Frutarom 55290
1 M Magnesium acetate Merck 1.05819.0250 Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate Carlo Erba 470147 Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate Merck 1.01116.1000 Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) Merck 8.07491.1000 Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) Sigma P8877 Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP) Sigma A3377 Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) Sigma G8877 Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP) ACROS ORGANICS 226310010 Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) INALCO INA-1758-1400 Genes expression induction.
2 M Sucrose J.T. Baker 1933078 Generating a density gradient.
2 M Glucose Sigma 16301 Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW) Bio-Lab 2321777500 DNase & RNase free
S30-T7 lysate _ _ Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components.
Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. 
Stock of DNA plasmid of choice _ _ Contains the sequence for the requested protein.
Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
PHMT Grant Bio  PSC18 Thermomixer
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor.
Suited for 15 mL sized tubes.
Preferably swinging buckets.
Should enable at least 1000 x g.
Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge Thermo Scientific 75002420 (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal.
Suited for Eppendorf vials.
Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes Thermo Scientific 339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086
Sterilized pipette tips Corning Sterilized by autoclave.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. . Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Tags

AI-based Protein ProductionCell-free Bacterial ExtractsLiposome-based Synthetic CellsEmulsion TransferIn-situ Therapeutic Protein SynthesisMetabolic Disease TreatmentProtein Replacement TherapiesCancer TherapyDiabetes Treatment
check_url/60829?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Adir, O., Sharf-Pauker, N., Chen, G., Kaduri, M., Krinsky, N., Shainsky-Roitman, J., Shklover, J., Schroeder, A. Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer. J. Vis. Exp. (158), e60829, doi:10.3791/60829 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image