Detta protokoll beskriver metod, material, utrustning och steg för nedifrån och upp-beredning av RNA och proteinproducerande syntetiska celler. Det inre vattenrummet i de syntetiska cellerna innehöll S30 bakteriella lysate inkapslade i en lipid bilayer (dvs. stabila liposomer), med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod.
Den nedifrån och upp monteringsmetod för konstruktion av syntetiska celler är ett effektivt verktyg för att isolera och undersöka cellulära processer i en cell härma miljö. Vidare har utvecklingen av cellfria uttryckssystem visat förmåga att rekonstruera proteinproduktion, transkription och översättningsprocesser (DNA→RNA→protein) på ett kontrollerat sätt, utnyttja syntetisk biologi. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda en cell-yttrandefrihet system, inklusive produktion av en potent bakteriell lysate och kapsla in denna lysate inuti kolesterol-rika lipid-baserade jätte unilamellar blåsor (GUVs) (dvs. stabila liposomer), att bilda syntetiska celler. I protokollet beskrivs metoderna för att förbereda komponenterna i de syntetiska cellerna, inklusive produktion av aktiva bakteriella lyserter, följt av en detaljerad steg-för-steg-beredning av de syntetiska cellerna baserat på en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod. Dessa underlättar produktionen av miljontals syntetiska celler på ett enkelt och prisvärt sätt med en hög mångsidighet för att producera olika typer av proteiner. De erhållna syntetiska cellerna kan användas för att undersöka protein/RNA-produktion och aktivitet i en isolerad miljö, i riktad evolution, och även som en kontrollerad drug delivery-plattform för on-demand-produktion av terapeutiska proteiner inuti kroppen.
Syntetiska celler är konstgjorda cellliknande partiklar, härma en eller flera funktioner i en levande cell, såsom förmågan att dela, bilda membran interaktioner, och syntetisera proteiner baserat på en genetisk kod1,2,3. Syntetiska celler som omsluter cellfria proteinsyntessystem (CFPS) har hög modularitet på grund av deras förmåga att producera olika proteiner och RNA-sekvenser efter förändringar i DNA-mallen. Cfps-system bygger på celllystnat, renade komponenter eller syntetiska komponenter och omfattar alla transkriptions- och översättningsmaskiner som krävs för proteinsyntes såsom ribosomer, RNA-polymeras, aminosyror och energikällor (t.ex. 3-fosfoglycerat och adenintriphosfat)4,,5,,6,,7,8,9. Inkapslingen av ett CFPS-system inuti lipidblåsor möjliggör enkel och effektiv produktion av proteiner utan att vara beroende av en levande cell10. Dessutom tillåter denna plattform syntes av peptider som kan försämras inuti naturliga celler, produktion av proteiner som är giftiga för levande celler, och ändra proteiner med icke-naturliga aminosyror11,12. Syntetiska celler har använts som modell för forskningsändamål som undersöker de minimala cellkomponenter som krävs för att möjliggöra cellliv ur ett evolutionärt perspektiv1,13. Syntetiska celler har också använts för att bygga och genomföra genetisk krets och som modeller för riktad evolution14,,15,16. Andra studier har fokuserat på syntetiska cellers förmåga att efterlikna den biologiska aktiviteten hos naturliga celler, som syftar till att ersätta skadade naturliga celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Dessutom visar förmågan hos dessa CFPS som kapslar in syntetiska celler att producera en mängd olika terapeutiska proteiner dess potential att införlivas i klinisk användning18.
Här beskriver vi ett bottom-up lab-skala protokoll (figur 1) för produktion av RNA och proteinproducerande syntetiska celler baserat på en CFPS system inkapslade i en lipid vesikel. Detta visar den potentiella användningen av syntetiska cellplattformar som nya drug delivery-system för produktion på plats av ett terapeutiskt proteinläkemedel in vivo19. Tidigare studier har undersökt optimering av CFPS-reaktionen och cell lysate förberedelseprocesserna4,,8,20. Dessutom har flera tekniker tillämpats för cellstor liposomberedning, såsom mikrofluidiska och polymerbaserade droppstabiliseringsmetoder21,22,23, som också skiljer sig åt i liposomernas lipidsammansättning24,,25,26. I det presenterade protokollet produceras syntetiska celler med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod och inkapslingsprocessen utförs vid låga temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Dessa milda förhållanden har visat sig vara gynnsamma för att behålla den biologiska funktionella integriteten hos det molekylära maskineriet, nämligen ribosomer och proteiner27,29,30. Partiklarnas lipidsammansättning består av både kolesterol och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den första finns i alla däggdjurscellmembran och är nödvändig för att membranet ska kunna minska stabiliteten, styvheten och permeabiliteten, och den senare efterliknar phospholipidsammansättningen11,,13. Den cellulära transkription och översättning molekylära maskiner extraheras från BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, som omvandlas med pAR1219 plasmid överuttryckA T7 RNA polymeras att öka CFPS potens och proteinsyntes. Detta system har använts för att producera diagnostiska och terapeutiska proteiner, med molekylvikter på upp till 66 kDa in vitro och in vivo19,31. Följande protokoll ger en enkel och effektiv metod för produktion av syntetiska cellsystemet, som kan ta itu med ett brett spektrum av grundläggande frågor i samband med proteinsyntes i naturen och kan också användas för drug delivery applikationer.
Detta protokoll inför en enkel och prisvärd metod för produktion av stora mängder proteinproducerande syntetiska celler. Avkastningen av aktiva celler är beroende av noggrann och korrekt utförande av protokollet med betoning på flera kritiska steg. I lysate förberedelse delen av denna metod, är det viktigt att nå lämplig bakteriedensitet innan celllys för att uppnå en tillräcklig mängd proteiner i den bakteriella lysate. För det andra bör lysprocessen utföras vid 4 °C och lysate fryst snabbt med flytan…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ERC-STG-2015-680242.
Författarna erkänner också stöd av Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; lastbil I. Lokey tvärvetenskapligt centrum för biovetenskap och teknik; Israel ekonomiministeriet för ett Kamin-bidrag (52752); Israels ministerium för vetenskapsteknik och rymdvetenskap – chefsforskarens kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israeliska stiftelsen för vetenskaplig forskning och utveckling för ett GIF-barnbidrag (I-2328-1139.10/2012); Europeiska unionens IRG-program för karriärintegration (908049). Phospholipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for cancer research, en Mallat Family Foundation Grant; och Unger Family Foundation. A. Schroeder erkänner Alon och Taub Fellowships. O. Adir erkänner Sherman och Gutwirth stipendier. G. Chen erkänner Sherman Fellowship. N. Krinsky erkänner Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program från Rothschild Caesarea Foundation.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |