Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

Summary

Detta protokoll beskriver metod, material, utrustning och steg för nedifrån och upp-beredning av RNA och proteinproducerande syntetiska celler. Det inre vattenrummet i de syntetiska cellerna innehöll S30 bakteriella lysate inkapslade i en lipid bilayer (dvs. stabila liposomer), med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod.

Abstract

Den nedifrån och upp monteringsmetod för konstruktion av syntetiska celler är ett effektivt verktyg för att isolera och undersöka cellulära processer i en cell härma miljö. Vidare har utvecklingen av cellfria uttryckssystem visat förmåga att rekonstruera proteinproduktion, transkription och översättningsprocesser (DNA→RNA→protein) på ett kontrollerat sätt, utnyttja syntetisk biologi. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda en cell-yttrandefrihet system, inklusive produktion av en potent bakteriell lysate och kapsla in denna lysate inuti kolesterol-rika lipid-baserade jätte unilamellar blåsor (GUVs) (dvs. stabila liposomer), att bilda syntetiska celler. I protokollet beskrivs metoderna för att förbereda komponenterna i de syntetiska cellerna, inklusive produktion av aktiva bakteriella lyserter, följt av en detaljerad steg-för-steg-beredning av de syntetiska cellerna baserat på en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod. Dessa underlättar produktionen av miljontals syntetiska celler på ett enkelt och prisvärt sätt med en hög mångsidighet för att producera olika typer av proteiner. De erhållna syntetiska cellerna kan användas för att undersöka protein/RNA-produktion och aktivitet i en isolerad miljö, i riktad evolution, och även som en kontrollerad drug delivery-plattform för on-demand-produktion av terapeutiska proteiner inuti kroppen.

Introduction

Syntetiska celler är konstgjorda cellliknande partiklar, härma en eller flera funktioner i en levande cell, såsom förmågan att dela, bilda membran interaktioner, och syntetisera proteiner baserat på en genetisk kod^1,2,3. Syntetiska celler som omsluter cellfria proteinsyntessystem (CFPS) har hög modularitet på grund av deras förmåga att producera olika proteiner och RNA-sekvenser efter förändringar i DNA-mallen. Cfps-system bygger på celllystnat, renade komponenter eller syntetiska komponenter och omfattar alla transkriptions- och översättningsmaskiner som krävs för proteinsyntes såsom ribosomer, RNA-polymeras, aminosyror och energikällor (t.ex. 3-fosfoglycerat och adenintriphosfat)^{4,,5,,6,,7,8,9}. Inkapslingen av ett CFPS-system inuti lipidblåsor möjliggör enkel och effektiv produktion av proteiner utan att vara beroende av en levande cell¹⁰. Dessutom tillåter denna plattform syntes av peptider som kan försämras inuti naturliga celler, produktion av proteiner som är giftiga för levande celler, och ändra proteiner med icke-naturliga aminosyror^11,12. Syntetiska celler har använts som modell för forskningsändamål som undersöker de minimala cellkomponenter som krävs för att möjliggöra cellliv ur ett evolutionärt perspektiv^1,13. Syntetiska celler har också använts för att bygga och genomföra genetisk krets och som modeller för riktad evolution^14,,15,16. Andra studier har fokuserat på syntetiska cellers förmåga att efterlikna den biologiska aktiviteten hos naturliga celler, som syftar till att ersätta skadade naturliga celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes¹⁷. Dessutom visar förmågan hos dessa CFPS som kapslar in syntetiska celler att producera en mängd olika terapeutiska proteiner dess potential att införlivas i klinisk användning¹⁸.

Här beskriver vi ett bottom-up lab-skala protokoll (figur 1) för produktion av RNA och proteinproducerande syntetiska celler baserat på en CFPS system inkapslade i en lipid vesikel. Detta visar den potentiella användningen av syntetiska cellplattformar som nya drug delivery-system för produktion på plats av ett terapeutiskt proteinläkemedel in vivo¹⁹. Tidigare studier har undersökt optimering av CFPS-reaktionen och cell lysate förberedelseprocesserna^4,,8,20. Dessutom har flera tekniker tillämpats för cellstor liposomberedning, såsom mikrofluidiska och polymerbaserade droppstabiliseringsmetoder^21,22,23, som också skiljer sig åt i liposomernas lipidsammansättning^24,,25,26. I det presenterade protokollet produceras syntetiska celler med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod och inkapslingsprocessen utförs vid låga temperaturer (<4 °C)^{5,,10,,24,27,28}. Dessa milda förhållanden har visat sig vara gynnsamma för att behålla den biologiska funktionella integriteten hos det molekylära maskineriet, nämligen ribosomer och proteiner^27,29,30. Partiklarnas lipidsammansättning består av både kolesterol och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den första finns i alla däggdjurscellmembran och är nödvändig för att membranet ska kunna minska stabiliteten, styvheten och permeabiliteten, och den senare efterliknar phospholipidsammansättningen^11,,13. Den cellulära transkription och översättning molekylära maskiner extraheras från BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, som omvandlas med pAR1219 plasmid överuttryckA T7 RNA polymeras att öka CFPS potens och proteinsyntes. Detta system har använts för att producera diagnostiska och terapeutiska proteiner, med molekylvikter på upp till 66 kDa in vitro och in vivo^19,31. Följande protokoll ger en enkel och effektiv metod för produktion av syntetiska cellsystemet, som kan ta itu med ett brett spektrum av grundläggande frågor i samband med proteinsyntes i naturen och kan också användas för drug delivery applikationer.

Protocol

OBS: Illustration av hela det syntetiska cellernas produktionsprotokoll presenteras i figur 1. Enligt användarens behov kan också proteinuttrycket (avsnitt 3.2) och syntetisk cellbildning (avsnitt 4) av protokollet utföras oberoende av dem (med vissa anpassningar). 1. Beredning av S30-T7 lysate Streak plattan E. coli BL21(DE3) bakterier omvandlas med T7 RNA polymeras uttrycker pAR1219 plasmid på en LB-agar platta kompletteras med 50 μg/mL a…

Representative Results

Vi presenterar ett protokoll för beredning av syntetiska celler genom att kapsla in en S30-T7 CFPS system baserat på BL21 E. coli inuti lipid blåsor. En schematisk beskrivning av förberedelseprocessen som innehåller en bild av varje steg presenteras i figur 2. Framgången för den syntetiska cellberedningsprocessen är beroende av lämplig prestanda för varje steg och utförs av olika parametrar. Protokollet bör justeras för att rymma produktionen av ett visst protein. <…

Discussion

Detta protokoll inför en enkel och prisvärd metod för produktion av stora mängder proteinproducerande syntetiska celler. Avkastningen av aktiva celler är beroende av noggrann och korrekt utförande av protokollet med betoning på flera kritiska steg. I lysate förberedelse delen av denna metod, är det viktigt att nå lämplig bakteriedensitet innan celllys för att uppnå en tillräcklig mängd proteiner i den bakteriella lysate. För det andra bör lysprocessen utföras vid 4 °C och lysate fryst snabbt med flytan…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.