Summary
Wir präsentieren ein murines Modell der Hirntodinduktion, um den Einfluss seiner pathophysiologischen Wirkungen auf Organe sowie auf konsekutive Transplantate im Kontext einer soliden Organtransplantation zu bewerten.
Abstract
Während sowohl die lebende Spende als auch die Spende nach dem Kreislauftod alternative Möglichkeiten für eine Organtransplantation bieten, stellt die Spende nach dem Hirntod (BD) nach wie vor die Hauptquelle für feste Transplantationen dar. Leider ist der irreversible Verlust der Gehirnfunktion bekannt, mehrere pathophysiologische Veränderungen zu induzieren, einschließlich hämodynamischer sowie hormoneller Veränderungen, die schließlich zu einer systemischen Entzündungsreaktion führen. Modelle, die eine systematische Untersuchung dieser Effekte in vivo ermöglichen, sind rar. Wir präsentieren ein murines Modell der BD-Induktion, das Untersuchungen über die verheerenden Auswirkungen von BD auf die Allograft-Qualität unterstützen könnte. Nach der Durchführung der intraarteriellen Blutdruckmessung über die gemeinsame Karotisarterie und der zuverlässigen Beatmung über eine Tracheostomie wird BD durch stetig steigenden intrakraniellen Druck mit einem Ballonkatheter induziert. Vier Stunden nach der BD-Induktion können Organe zur Analyse oder für weitere Transplantationsverfahren geerntet werden. Unsere Strategie ermöglicht die umfassende Analyse von Spender-BD in einem murinen Modell, wodurch ein vertieftes Verständnis der BD-bezogenen Effekte bei der Festorgantransplantation ermöglicht und potenziell der Weg zu einer optimierten Organvorkonditionierung geebnet wird.
Introduction
Die Transplantation ist derzeit die einzige heilende Behandlung für Organversagen im Endstadium. Bisher waren Patienten mit Hirntod (BD) die Hauptquelle für Organspenden, obwohl lebende Spende und Spende nach Kreislauftod wertvolle Alternativen sind1. BD wird durch ein irreversibles Koma (mit einer bekannten Ursache), das Fehlen von Hirnstammreflexen und Apnoe2definiert. Leider zeigen BD-Organe minderwertige Ergebnisse im langfristigen Transplantatüberleben unabhängig von humanem Leukozyten-Antigen (HLA)-Missverhältnis und kalter ischämischer Zeit3. In der Zwischenzeit wurde intensive Forschung an diesem antigenunabhängigen Risikofaktor durchgeführt, was zu drei Hauptaspekten pathophysiologischer Veränderungen führte, die als Folge von BD vermittelt wurden: hämodynamisch, hormonell und entzündlich4.
Bis heute wurden experimentelle BD-Modelle bei Nagetieren hauptsächlich mit Ratten durchgeführt. Um einen besseren Einblick in die immunologischen Folgen fester Organe nach BD zu gewinnen, wollten wir ein murines BD-Modell etablieren, da derzeit nur Mausmodelle umfassende Untersuchungen genetischer oder immunologischer Faktoren ermöglichen. In diesem Zusammenhang bietet das Maussystem eine größere Auswahl an Analysewerkzeugen.
Das hier beschriebene Prinzip der BD-Induktion basiert auf einer Erhöhung des intrakraniellen Drucks, der durch die Inflation eines ballonkatheter unter dem Schädel eingesetzten Ballonkatheters induziert wird. Erhöhter intrakranieller Druck imitiert den physiologischen Mechanismus von BD, indem er die Perfusion des Großhirns, Kleinhirns und des Hirnstamms5,6blockiert. Um eine ausreichende Durchblutung der peripheren Organe zu gewährleisten, ist die Blutdruckmessung während des Eingriffs obligatorisch. Der zu diesem Zweck verwendete Katheter dient gleichzeitig der Kochlinie, um den Blutdruck durch Flüssigkeitssubstitution zu stabilisieren. Da BD mit der Einstellung der spontanen Atmung einhergeht, muss eine ausreichende Beatmung gewährleistet sein. Eine elektrische Decke hält die physiologische Körperkörpertemperatur aufrecht.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell eingehende Studien über den Einfluss von BD-induzierten Verletzungen, auf Leukozytenmigration7, Komplimentaktivierung8, ischämische Reperfusionsverletzung9und andere Faktoren ermöglichen wird.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierpflege durchgeführt, die von der National Society for Medical Research und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der National Academy of Science erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurden (NIH-Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 1985). Alle Experimente wurden vom österreichischen Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur genehmigt (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Arterielle Katheterisierung
- Anästhetisieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin10 und einem Schmerzmittel nach lokaler Praxis (z.B. Buprenorphin). Kneifen Sie die Hinterbeine mit Zangen, um die richtige Tiefe der Anästhesie zu bestätigen.
HINWEIS: Für diese Studie wurden männliche C57BL/6N-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet (Gewicht 20 bis 25 g). Die Autoren haben männliche BALB/c des gleichen Alters erfolglos getestet, aber keine anderen Stämme ausprobiert (siehe Diskussion). - Entfernen Sie das Haar in den Bereichen von Interesse (Kopf, Hals) mit einem elektrischen Rasiermesser. Stellen Sie sicher, dass kein loses Haar übrig bleibt, um eine Wundkontamination zu verhindern. Anschließend desinfizieren Sie das Operationsfeld mit 70% Ethanol/Chlorhexidin/Betadin und legen Sie die Maussupine mit dem Kopf zum Chirurgen.
- Machen Sie einen zervikalen Mittellinienschnitt mit einer Sezierenderschere.
- Sezieren Sie die submandibulären Drüsen und Halsmuskelgewebe und trennen Sie sie, um die gemeinsame Halsschlagader freizulegen. Verwenden Sie meist stumpfe Sezierung über Zangen.
- Platz drei 8-0 Seidenligaturen unter der rechten gemeinsamen Halsschlagader.
- Legen Sie eine Klemme auf die proximale Ligatur und bringen Sie Spannung in die Arterie, so dass der Fluss aufgehängt wird.
- Schließen Sie die distale Ligatur.
- Setzen Sie den arteriellen Katheter durch ein kleines, vorgeformtes Hautloch auf den Schädelaspekt des Einschnitts. Drücken und verformen Sie das Lumen des Katheters, wenn es zu groß erscheint, um den Blutrückfluss zu reduzieren. Fixieren Sie mit allen drei Ligaturen.
- Fixieren Sie den Katheter auf die Haut, um Verwerfungen zu vermeiden. Dazu eine Naht (z.B. 5-0 Monofilament, nicht resorbierbar), die den Katheter im Bereich des vorgeformten Hautlochs mit der Haut verbindet.
2. Tracheostomie
- Sezieren Sie die vortracheale Muskulatur unverblümt mit Zangen.
- Platz zwei 8-0 Seidenligaturen unter der Luftröhre.
- Tracheotomisieren Sie mit Mikroschere so proximal wie möglich, um einseitige Belüftung zu vermeiden. Verwenden Sie eine horizontale Schnittlinie zwischen zwei Trachealknorpeln.
- Legen Sie das Lüftungsrohr ein und fixieren Sie es mit beiden vorbereiteten Ligaturen.
HINWEIS: Das proximale Ende der Luftröhre muss nicht geligiert werden. - Schließen Sie die Haut mit einer laufenden Naht (z.B. 6-0 Monofilament, nicht resorbierbar).
- Belüften Sie die Maus mit einer Frequenz von 150/min und einem Gezeitenvolumen von 200 l.
3. Hirntodinduktion
- Ordnen Sie die Maus an die anfällige Position an.
- Entfernen Sie die Haut aus dem Schädel mit chirurgischer Schere und Zange, um die Haut zu halten.
- Bohren Sie ein 1 mm Kaliber Bohrung paramedial über dem linken parietalen Kortex. Beenden Sie das Bohren, bevor Sie den inneren kompakten Knochen und den Dura mater durchbrechen.
- Durchdringen Sie die letzte Gewebebrücke des Schädels mit stumpfer Zange und entfernen Sie scharfe Kanten.
- Setzen Sie den Ballonkatheter ein, so dass er vollständig in der Schädelhöhle liegt. Stellen Sie sicher, dass der Ballon mit Einer Linie vorgefüllt ist und die gesamte Luft evakuiert wird.
- Beginnen Sie die Inflation mit hilfe einer Spritzenpumpe bei 0,1 ml/min über einen Zeitraum von 10 bis 15 min (Gesamtvolumen von 0,8 bis 1,2 ml).
HINWEIS: Die Maus wird Myoklonus, Mydriasis, weitere Anfallsaktivität und agonale Gase zeigen. - Aussprechen Sie das Maushirn tot, sobald der Schwanz der Maus steif geworden ist und errichtet.
HINWEIS: BD wird durch eine charakteristische anfängliche Blutdruckspitze (Cushing Reflex), das Fehlen von Hirnstammreflexen und spontane Atmung bestätigt. Regelmäßige Apnoetests sollten während der Experimente vermieden werden, da Mäuse aufgrund eines Sauerstoffmangels kreislaufinstabil werden können. - Stoppen Sie die Inflation des Ballonkatheters.
- Legen Sie eine Heizdecke über die Maus, um Unterkühlung zu vermeiden.
4. Während der BD-Periode
- Überwachen und dokumentieren Sie den Blutdruck regelmäßig. Auszuschließen Mäuse mit einer längeren hypotensiven Phase (mittlerer arterieller Druck [MAP] < 50 mmHg für >30 min).
- Infuse 0,1 ml Kochchen alle 30 min, um den Blutdruck der Maus zu stabilisieren.
HINWEIS: In dieser Studie wurden jeder Maus insgesamt 0,8 ml Saline verabreicht. - Nach 4 h BD-Dauer Mausorgane/-gewebe ernten. Schließen Sie die Maus aus dem Experiment aus, wenn das Herz der Maus am Ende des Experiments nicht schlägt.
5. Scheinverfahren
- Führen Sie die Schritte 1.1-3.3 aus.
HINWEIS: Öffnen Sie den inneren kompakten Knochen nicht. Fügen Sie keinen Ballonkatheter ein oder aufblasen. - Bleiben Sie in der Nähe der Maus und beobachten Sie kontinuierlich das Tier. Immer wieder die Hinterbeine mit Zangen kneifen, um die richtige Tiefe der Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie zusätzliche Anästhesie subkutan auf (ca. 1/2 der Anfangsdosis), wenn die Maus Anzeichen des Erwachens zeigt, was unserer Erfahrung nach etwa nach 2 x 3 h nach der Anästhesie geschieht.
- Tragen Sie die gleiche Menge an intravenöser Saline wie bei den BD-Mäusen auf.
HINWEIS: Die Scheinmaus wird nach Beendigung der Beatmung wieder spontane Atmung. Die BD-Maus wird dies nicht tun. Apnoe-Tests sollten während der Erstellung des Modells durchgeführt werden, aber während der Experimente sollte es aufgrund unnötiger physiologischer Belastung vermieden werden.
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Representative Results
Das murine BD-Modell wurde mehr als 100 Mal mit einer Erfolgsrate von über 90% erfolgreich durchgeführt. Zusätzlich wurde eine postinterventionelle Organtransplantation von Herz und Niere sicher durchgeführt7.
BD induziert eine Vielzahl pathophysiologischer Veränderungen, die mit diesem Modell weiter untersucht werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, zeigt der Blutdruck einen anfänglichen hypertensiven Spitzenwert, gefolgt von einer längeren blutdrucksenkenden Phase. Um schädliche physiologische Auswirkungen der Hypotonie zu vermeiden, wurden Mäuse mit einem längeren unzureichenden Blutdruck (MAP < 50 mmHg für mehr als 30 min) ausgeschlossen.
Eine weitere etablierte Beobachtung ist, dass BD-Induktion zur Aktivierung des Immunsystems führt. Nach 4 h BD-Dauer wurde eine organspezifische Upregulation von Immunmarkern auf mRNA-Ebene (Abbildung 2) sowie Immunzellmigration beobachtet7.
Abbildung 1: Invasive Messung des mittleren arteriellen Drucks (MAP) nach BD-Induktions- oder Scheinverfahren. Zum Zeitpunkt der BD-Induktion war der Blutdruck bei BD-Tieren (weiße Quadrate) signifikant höher als bei Scheintieren (schwarze Quadrate), was durch den gut beschriebenen Zytokinsturm erklärt wird; danach wurde eine Normalisierung des Blutdruckspiegels deutlich, gefolgt von einer Phase sinkender Druckwerte ab 90 min BD-Induktion (n = 19 Tiere/Gruppe SD). Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit zweiseitig ANOVA und dem Bonferroni-Posttest getestet; **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: BD-Induktion aktiviert das Immunsystem und verursacht direkte Organschäden vor der Transplantation. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse des natürlichen Zytotoxizitätauslösenden Rezeptors 1 (NCR1 auch NK-p46), der in den Nieren als Folge von BD auf mRNA-Ebene zunimmt. Es wurden keine Veränderungen in Lebern oder Herzen beobachtet. Die Daten werden als Mittelwert von n = 7 x 8 Tieren/Gruppe dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen BD und Schein wurden mit dem Mann-Whitney U-Test getestet; **p = 0,0037. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
BD, ein Risikofaktor für Allograft-Qualität bei Multiorganspendern, bringt eine Fülle pathophysiologischer Veränderungen mit sich, die nur mit In-vivo-Modellen ausreichend bewertet werden können. Hämodynamische Veränderungen, Zytokinsturm, hormonelle Veränderungen und ihre letztendliche Auswirkung auf die Qualität und das Überleben von Organtransplantaten können nicht in vitro analysiert werden4. Der Großteil der Basistransplantationen sowie der immunologischen Forschung ist von ausgeklügelten diagnostischen Werkzeugen abhängig, die nur in Mäusemodellen weit verbreitet sind. Mäusemodelle haben bereits zu einer Vielzahl neuer Erkenntnisse in der BD-bezogenen Forschung7,8,9geführt.
Während im 20. Jahrhundert die ersten Modelle für die BD-Forschung in Pavianen, Hunden und Schweinen11,12entwickelt wurden, wurde erst 1996 das erste Rattenmodell13beschrieben. Weitere 14 Jahre dauerte es, bis 2010 erstmals ein murines BD-Modell von der Wiener Gruppe veröffentlicht wurde6. Obwohl jeder einzelne Schritt für einen ausgebildeten Mikrochirurgen keine Herausforderung darstellt, bleibt das hier beschriebene Modell zerbrechlich und kann einige Wochen in Anspruch nehmen.
Kritische Schritte dieses Protokolls sind wie folgt. Verwenden Sie sterile Einwegartikel (insbesondere den arteriellen Katheter und Verbindungsrohre), um unerwünschte Immunstimulation zu vermeiden. Vermeiden Sie jeden Blutverlust, da eine blutdrucksenkende Phase unkontrollierbar werden kann. Verwenden Sie kleine Kanülen für die Blutdruckmessung oder reduzieren Sie das Lumen, um Blutrückfluss zu vermeiden. Befestigen Sie das Lüftungsrohr sowie die arterielle Kanüle, um Verrenkungen beim Drehen der Maus oder während der Anfallsaktivität zu vermeiden. Das Bohrloch darf nicht scharfkantig sein und sollte nicht zu groß sein. Der Ballonkatheter sollte in Kontakt mit dem Bohrloch sein. Andernfalls kann Hirngewebe herausragen und die beabsichtigte Erhöhung des intrakraniellen Drucks behindern. Während der BD-Periode intravenöse Flüssigkeit kontinuierlich verabreichen. Wenn Mäuse zu früh im Prozess blutdrucksenkend werden (MAP < 50 mmHg nach 2-3 h), ist es unwahrscheinlich, dass eine zusätzliche Flüssigkeitsreanimation eine nachhaltige Aufrechterhaltung des Blutdrucks zur Verfügung stellt.
Die meisten Probleme traten während der BD-Induktion über den Ballonkatheter selbst auf oder wurden im Laufe der BD-Periode offensichtlich. Der gemeinsame Endpunkt aller Ungenauigkeiten wird Hypotonie trotz flüssigkeitsverabreichung sein. Je nach Blutdruckstabilität kann die BD-Dauer verlängert oder verkürzt werden. In der Literatur wurden unterschiedliche Zeiträume von 3 bis 6 h umgesetzt6,7,8. Der Erfolg der BD-Induktion kann auch zwischen verschiedenen Mausstämmen variieren. Obwohl anatomische Varianten zwischen Mäusestämmen begrenzt sein sollten, konnten wir bei BALB/c-Mäusen nicht das gleiche Modell etablieren. Obwohl der Aufwand auf wenige Mäuse beschränkt war und keine anderen Stämme getestet wurden, empfehlen wir die Verwendung von C57BL/6, die in den meisten früherenForschungen8,9verwendet wurde. Die Autoren haben keine zufriedenstellende Erklärung, warum das Modell nicht in BALB/c-Stamm funktionierte. Nur eine Publikation hat bisher ein BD-Modell mit großen (35 g) weiblichen OF-1-Mäusen6gezeigt.
Zusammenfassend stellt das hier beschriebene Mausmodell ein wertvolles Werkzeug dar, um eine Vielzahl pathophysiologischer Veränderungen zu untersuchen, die durch BD verursacht werden. Obwohl das Modell anspruchsvoll ist, kann es innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens optimiert und in standardisierter Weise mit einer hohen Erfolgsquote durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
K.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
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