单核细胞分离研究人类粘膜淋巴组织中先天免疫反应
Summary
在本协议中，我们解释了如何轻松地处理和培养来自健康人类的扁桃体单核细胞，从接受部分手术扁桃体切除术，以研究激活时的先天免疫反应，模仿粘膜组织中的病毒感染。
Abstract
研究粘膜相关淋巴组织（MALT）的分离细胞，可以理解涉及粘膜免疫的病理学中的免疫细胞反应，因为它们可以模拟组织中宿主-病原体相互作用。虽然从组织中提取的分离细胞是第一个细胞培养模型，但由于组织难以获得，它们的使用一直被忽视。在本协议中，我们解释了如何从健康的人类扁桃体中轻松处理和培养扁桃体单核细胞（TPC），以研究激活时的先天免疫反应，模仿粘膜组织中的病毒感染。TCC与扁桃体分离是快速的，因为扁桃体几乎没有任何上皮，并产生高达数十亿所有主要免疫细胞类型。该方法允许使用多种技术检测细胞因子的产生，包括免疫测定、qPCR、显微镜、流细胞测定等，类似于从血液中使用外周单核细胞（PBMC）。此外，TPC 对药物检测的敏感性高于 PBMC，未来毒性检测需要考虑这一点。因此，前维质TCC培养是一种简单易用的粘膜模型。
Introduction
由于可及性以及明显的伦理原因，对人体器官的研究受到限制。然而，它们对于完全理解人类生物学的复杂性至关重要。分离细胞（原发物系或细胞系）的培养物是细胞生物学研究中的标准系统，因为它们的可用性。虽然分离的细胞培养允许杰出的发现，但细胞系的使用却受到更密切的审查，因为它们在体内器官生物学中并不完全模仿。然而，三维细胞或组织外植的培养高度复杂44，5，6。5,6事实上，一块组织或器官是高度异质的，因为它的细胞组成因组织中的定位而异。因此，使用组织块需要分析许多技术和生物复制，导致需要大量捐赠者或患者。
粘膜相关的淋巴组织（MALT）在结构上与淋巴结相似，但具有独特的功能，因为它们的主要作用是调节粘膜免疫7。与淋巴结（通常位于与组织距离）不同，MALT通常位于粘膜组织上皮的正下方。从组织学上讲，它们主要由高浓度的B和T细胞组成，但也由抗原呈现细胞组成，如巨噬细胞和树突细胞。MALT约占人体淋巴组织的50%。MALT根据其位置细分为九组：GALT（古特-）、BALT（布朗丘斯-）、NALT（鼻腔）、CALT（结节）、LALT（喉部）、SALT（皮肤）、VALT（vulvo-）、O-MALT（组织）和D-MALT（扩散）。O-MALT主要由瓦尔德耶扁桃体环的扁桃体组成，是最容易接触的MALT88、9。9事实上，位于奥罗巴林的扁桃体是保护消化道和呼吸道免受（潜在）侵入性微生物侵害的主要屏障10。此外，扁桃体被细分层的鳞状非角质上皮覆盖，由含有血管、神经和淋巴的结缔组织胶囊支撑，便于进入免疫细胞11，12。11,此外，扁桃体切除术是切除扁桃体手术，是治疗睡眠障碍呼吸的儿童的常见手术，使扁桃体在生理环境中很容易获得组织13。
通西尔允许研究涉及粘膜免疫的病理学中的免疫细胞反应。事实上，在HIV感染中，由于扁桃体是由高浓度的免疫细胞组成的，它们是病毒复制的主要目标，但也产生大量的细胞因子，在循环中未检测到14，15。,15在稳定状态下，各种粘膜组织（包括扁桃体）中存在罕见的先天性细胞，但基本上不在血液中。
因此，吨位体单核细胞（TPC）是一个比PBPC更相关和复杂的模型，可以回答更深刻的问题。另一方面，组织外植物的使用可能很复杂，并不总是与先天免疫研究相关。因此，我们建立了一个模型来研究使用TCC16粘膜免疫活化。在这里，我们描述了一种将TCC与新鲜人类扁桃体有效隔离的方法。这种方法允许恢复大量的免疫细胞，同时保持其完整性，用于前活体研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
人类扁桃体代表一个综合和生理的外活体模型，用于研究粘膜界面的先天免疫反应，因为它们模仿了二次淋巴器官的作用。有趣的是，TPC的细胞组成与PBMC相似，包括所有主要细胞群，尽管它们的百分比与血液中的PBMC不同（图1）。也可以发现额外的种群，因为所有的免疫反应都是在组织（粘血或继发淋巴器官）中启动的，而不是血液中。
使用人体组织?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家国防和保全会的支持。H） 用于实验和 N.B. 研究金（AAP 2017 166）。N.S. 感谢ANRS对奖学金（AAP 2016 1）、欧洲分子生物学组织EMBO奖学金（LT 834 2017）、乌尔姆大学医学院（LSBN.0147）和德国福森斯格梅施泰因施夫DFG（SM 544/1）的启动资助计划的支持。
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
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