Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano
Summary
No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.
Abstract
Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.
Introduction
Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa4,,5,6. De fato, um pedaço de tecido ou órgão é altamente heterogênios porque sua composição celular difere dependendo da localização no tecido. Assim, o uso de blocos teciduais requer a análise de muitas réplicas técnicas e biológicas, levando à necessidade de um grande número de doadores ou pacientes.
Os tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) são estruturalmente semelhantes aos linfonodos, mas têm funções únicas, pois seu principal papel é regular a imunidade mucosa7. Ao contrário dos linfonodos, que geralmente estão localizados a alguma distância dos tecidos, o MALT geralmente está localizado imediatamente abaixo do epitélio do tecido mucosal. Histologicamente, eles são compostos principalmente de altas concentrações de células B e T, mas também células que apresentam antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Malt constituem cerca de 50% do tecido linfoide no corpo humano. Malt são subdivididos em nove grupos, dependendo de sua localização: GALT (intestino),BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntivista), LALT (laringe-), SALT (pele-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) e D-MALT (difundido). O O-MALT é composto principalmente pelas amígdalas do anel de amígdalas de Waldeyer e é o MALT8,,9. De fato, as amígdalas localizadas na orofaringe constituem a principal barreira que protege os tratos digestivos e respiratórios dos (potenciais) microrganismos invasivos10. Além disso, as amígdalas são cobertas por um epitélio escânio estratificado estratificado, apoiado por uma cápsula de tecido conjuntivo contendo vasos sanguíneos, nervos e linfáticos, proporcionando fácil acesso às células imunes11,,12. Além disso, a amigdaxia, o ato cirúrgico de remoção de amígdalas, é um procedimento comum realizado em crianças com respiração desordenada do sono, tornando as amígdalas um tecido facilmente disponível13 em ambientes fisiológicos.
As amígdalas permitem o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. De fato, na infecção pelo HIV, como as amígdalas são compostas por uma alta concentração de células imunes, elas são o principal alvo da replicação viral, mas também produzem uma grande quantidade de citocinas que não são detectadas na circulação14,15. Em estados estáveis, populações raras de células inatas estão presentes em vários tecidos mucosas, incluindo as amígdalas, mas estão essencialmente ausentes do sangue.
Assim, as células mononucleares de amígdalas (TMCs) são um modelo mais relevante e complexo do que os PBMCs e podem responder a perguntas mais profundas. Por outro lado, o uso de explants teciduais pode ser complexo e nem sempre relevante para estudos imunológicos inatas. Assim, estabelecemos um modelo para estudar a ativação imunológica mucosa utilizando TMCs16. Aqui, descrevemos um método para o isolamento eficiente dos TMCs de amígdalas humanas frescas. Este método permite a recuperação de um grande número de células imunes, mantendo sua integridade para estudos ex vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são inicia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups “Baustein” da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
Referências
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