Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano
Summary
En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.
Abstract
El estudio de las células aisladas de los tejidos linfoide asociados a la mucosa (MALT) permite comprender la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa, ya que pueden modelar interacciones huésped-patógeno en el tejido. Mientras que las células aisladas derivadas de los tejidos fueron el primer modelo de cultivo celular, su uso se ha descuidado porque el tejido puede ser difícil de obtener. En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amiglares (TMC) a partir de amígdalas humanas sanas para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa. El aislamiento de los TMC de las amígdalas es rápido, porque las amígdalas apenas tienen epitelio y producen hasta miles de millones de todos los principales tipos de células inmunitarias. Este método permite la detección de la producción de citoquinas utilizando varias técnicas, incluyendo inmunoensayos, qPCR, microscopía, citometría de flujo, etc., similar al uso de células mononucleares periféricas (PBMC) de la sangre. Además, los TMC muestran una mayor sensibilidad a las pruebas de drogas que los PBMC, que deben ser considerados para futuros ensayos de toxicidad. Por lo tanto, las culturas de TMCs ex vivo son un modelo mucoso fácil y accesible.
Introduction
Los estudios sobre órganos humanos están restringidos debido a la accesibilidad, así como razones éticas obvias. Sin embargo, son esenciales para comprender plenamente la complejidad de la biología humana. Los cultivos de células aisladas (cultivos primarios o líneas celulares) son un sistema estándar en los estudios de biología celular debido a su disponibilidad. Si bien los cultivos celulares aislados han permitido descubrimientos sobresalientes, el uso de líneas celulares se ha visto un mayor escrutinio porque no imitan completamente la biología de órganos in vivo. Sin embargo, el cultivo de células tridimensionales o explantes de tejidos es altamente complejo4,,5,,6. De hecho, un pedazo de tejido u órgano es altamente heterogéneo porque su composición celular difiere dependiendo de la localización en el tejido. Por lo tanto, el uso de bloques de tejido requiere el análisis de muchas réplicas técnicas y biológicas, lo que lleva a la necesidad de un gran número de donantes o pacientes.
Los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) son estructuralmente similares a los ganglios linfáticos pero tienen funciones únicas, porque su función principal es regular la inmunidad a la mucosa7. A diferencia de los ganglios linfáticos, que generalmente se encuentran a cierta distancia de los tejidos, el MALT generalmente se encuentra inmediatamente debajo del epitelio del tejido mucoso. Histológicamente, se componen principalmente de altas concentraciones de células B y T, pero también células que presentan antígenos como macrófagos y células dendríticas. MalT constituyen alrededor del 50% del tejido linfoide en el cuerpo humano. MALT se subdivide en nueve grupos dependiendo de su ubicación: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntival), LALT (laringe-), SALT (piel-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) y D-MALT (difuso). El O-MALT se compone principalmente de las amígdalas del anillo amigdal de Waldeyer y es el MALT8,,9. De hecho, las amígdalas ubicadas en la orofaringe constituyen la principal barrera que protege las vías digestivas y respiratorias de los microorganismos (potenciales) invasivos10. Además, las amígdalas están cubiertas por un epítelio escamoso estratificado fino no queratinizante, apoyado por una cápsula de tejido conectivo que contiene vasos sanguíneos, nervios y linfáticos, proporcionando un fácil acceso a las células inmunitarias11,12. Además, la amigdalectomía, el acto quirúrgico de extirpar amígdalas, es un procedimiento común realizado en niños con respiración desordenada del sueño, haciendo de las amígdalas un tejido fácilmente disponible13 en entornos fisiológicos.
Las amígdalas permiten el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. De hecho, en la infección por el VIH, debido a que las amígdalas se componen de una alta concentración de células inmunitarias, son el principal objetivo de replicación viral, pero también producen una gran cantidad de citoquinas que no se detectan en la circulación14,,15. En estados estables, poblaciones raras de células innatas están presentes en varios tejidos mucosos, incluyendo las amígdalas, pero están esencialmente ausentes de la sangre.
Por lo tanto, las células mononucleares de las amígdalas (TMC) son un modelo más relevante y complejo que los PBMC y pueden responder a preguntas más profundas. Por otro lado, el uso de tejidos explantes puede ser complejo y no siempre relevante para los estudios inmunes innatos. Así, establecimos un modelo para estudiar la activación inmune de la mucosa utilizando LOS TMC16. Aquí, describimos un método para el aislamiento eficiente de los TMC de las amígdalas humanas frescas. Este método permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias manteniendo su integridad para estudios ex vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las amígdalas humanas representan un modelo integrador y fisiológico ex vivo para estudiar las respuestas inmunitarias innatas en la interfaz mucosa, porque imitan el papel de un órgano linfoide secundario. Curiosamente, la composición celular de los TMC es similar a las PBMC e incluye todas las principales poblaciones celulares, aunque su porcentaje puede ser diferente de los PBMC de la sangre (Figura 1). También se pueden encontrar poblaciones adicionales, ya que todas las respuestas …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para los experimentos y la beca N.B. (AAP 2017 166). N.S. reconoce el apoyo de la ANRS para la beca (AAP 2016 1), la Organización Europea de Biología Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), el programa de financiación de startups “Baustein” de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (LSBN.0147) y el Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
Referências
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
