No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.
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Artigo de método
Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.
Introdução
Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa
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Protocolo
Os espécimes não são coletados especificamente para fins de pesquisa e o estudo não é considerado invasivo. No entanto, a coleta de amígdalas humanas requer aprovação ética das autoridades locais relevantes. No nosso caso, foi aprovado pelo Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Além disso, solicita-se o consentimento de cada paciente ou representante legal para obter dados pessoais dos doadores (por exemplo, sexo, idade, histórico de infecções por ENT) que possam ajudar a interpretar resultados experimentais.
1. Manuseio do tecido tonsilar humano
- Coloque amígdalas de cada doador em um frasco estéril de ....
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Resultados
Primeiro caracterizamos o perfil imunológico das células presentes na cultura e analisamos a quantidade de TMCs. Nós fenítipamos os TMCs de amígdalas com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1,todos os principais tipos de células imunes presentes em PBMCs do sangue foram representadores nos TMCs das amígdalas. No entanto, nos TMCs a frequência de todos os tipos de células, exceto as células B, foram menores do que em PBMCs.
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Discussão
As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são iniciadas em tecidos (.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups "Baustein" da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Grade de aço de 10 malhas - 1910 µ m | Dutscher | 198586 | Para colocar no filtro de células Cellector |
| 60 malhas grade de aço - 230 µ m | Dutscher | 198591 | Para colocar no filtro de células Cellector |
| 70 µ m filtros de células ClearLine brancos | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergente | Dutscher | 59852 | Detergente |
| Solução antibiótica, 100x | Thermo | Fisher 15140122 | 100 U/mL Penicilium e 100 μ g/mL de estreptomicina - para adicionar aos meios de cultura |
| Tubos de fundo redondo BD FalconTM, tubos | Biosciences | 352063 | FACS |
| Filtro de células Cellector, 85 mL e 37 mm de diâmetro | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Ensaio de viabilidade celular luminescente | Promega | G7572 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | ||
| Tubos cônicos Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Pinças curvas | Dutscher | 711200 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Sem cálcio e magnésio |
| EnVision | PerkinElmer | Mede a luminescência | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Para adicionar aos meios de cultura | ||
| Marcadores de fluorescência anticorpos | Consulte a Tabela 1 | ||
| Pilão de vidro | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Uso a 20 mM |
| Incubadora | |||
| LEGENDplex Painel de Resposta Antivírus Humano | BioLegend | 740390 | Imunoensaio baseado em grânulos |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Gradiente de densidade médio |
| Mr. Recipiente Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | Recipiente de congelamento lento |
| Pierce 16% Formaldeído (p/v), sem metanol | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonista |
| RPMI-1640 Placa | SPL Sigma-Aldrich | R8758 | |
| , 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Lâmina cirúrgica estéril N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Contas de Compensação | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo | Fisher 15575020 | Para fazer tampão de lavagem em PBS |
Referências
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
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Reimpressões e permissões
