عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة بسهولة وتربية الخلايا أحادية النوى tonsillaar من البشر الأصحاء التي تخضع لعملية استئصال اللوزتين الجراحية الجزئية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية.
Abstract
دراسة الخلايا المعزولة من الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) يسمح فهم استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية، لأنها يمكن أن نموذج التفاعلات المضيف الممرض في الأنسجة. في حين أن الخلايا المعزولة المستمدة من الأنسجة كانت أول نموذج لثقافة الخلية ، فقد تم إهمال استخدامها لأن الأنسجة قد يكون من الصعب الحصول عليها. في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة وتربية الخلايا أحادية النوى اللوزتين بسهولة (TMCs) من اللوزتين البشرية السليمة لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية. إن عزل اللجان عبر الأراضي المُمَرَكَة من اللوزتين سريع، لأن اللوزتين بالكاد تحتويان على ظهارة وتُسفر عن مليارات من جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية. هذه الطريقة تسمح بالكشف عن إنتاج السيتوكين باستخدام عدة تقنيات، بما في ذلك immunoassays، qPCR، المجهر، تدفق cytometry، الخ. ، على غرار استخدام الخلايا أحادية النوى الطرفية (PBMCs) من الدم. وعلاوة على ذلك، تبدي الشركات عبر الأراضي عبر الوطنية حساسية أكبر لاختبار المخدرات من تلك التي تبديها شركات PBMCs، التي ينبغي النظر فيها من أجل إجراء اختبارات السمية في المستقبل. وهكذا، فإن ثقافات شركات TMCs التي تعمل في الجسم الحي هي نموذج مخاطي سهل وسهل الوصول إليه.
Introduction
وتقتصر الدراسات على الأعضاء البشرية بسبب إمكانية الوصول إلى المعلومات، فضلا عن أسباب أخلاقية واضحة. ومع ذلك ، فهي ضرورية لفهم تعقيد البيولوجيا البشرية بشكل كامل. ثقافات الخلايا المعزولة (الثقافات الأولية أو خطوط الخلايا) هي نظام قياسي في دراسات بيولوجيا الخلايا بسبب توافرها. في حين أن الثقافات الخلية المعزولة سمحت باكتشافات بارزة ، فإن استخدام خطوط الخلايا قد جاء عند التدقيق الدقيق لأنها لا تحاكي تمامًا بيولوجيا الجهاز الحي. ومع ذلك ، فإن ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد أو الأنسجة explants معقدة للغاية4،5،6. في الواقع ، قطعة من الأنسجة أو الجهاز هيطروجينية للغاية لأن تكوينها الخلوي يختلف اعتمادًا على التعريب في الأنسجة. وهكذا، فإن استخدام كتل الأنسجة يتطلب تحليل العديد من النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية، مما يؤدي إلى حاجة عدد كبير من المتبرعين أو المرضى.
الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) مشابهة هيكلياً للغدد الليمفاوية ولكن لها وظائف فريدة من نوعها، لأن دورها الرئيسي هو تنظيم المناعة المخاطية7. على عكس الغدد الليمفاوية، والتي تقع عادة على مسافة ما من الأنسجة، وتقع الشعير عادة مباشرة تحت ظهارة الأنسجة المخاطية. من الناحية النسيجية ، تتكون بشكل رئيسي من تركيزات عالية من الخلايا B و T ، ولكن أيضًا الخلايا التي تقدم المستضد مثل الضامة والخلايا التكجرية. الشعير تشكل حوالي 50٪ من الأنسجة اللمفاوية في جسم الإنسان. وتنقسم الشعير إلى تسع مجموعات اعتمادا على موقعها: غالت (القناة الهضمية- ) ، BALT (bronchus-) ، NALT (الأنف – ) ، CALT (الملتحمة) ، LALT (الحنجرة – ) ، SALT (الجلد – ) ، VALT (vulvo-) ، O -MALT (منظمة) ، ود – مالت (منتشر). و O-MALT يتكون أساسا من اللوزتين من خاتم لوزتيلار والداير وهو الأكثر سهولة MALT8,9. في الواقع، اللوزتين الموجودة في البلعوم تشكل الحاجز الرئيسي لحماية الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي من (المحتملة) الكائنات الحية الدقيقة الغازية10. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية اللوزتين من قبل ظهارة حرشفية غير كيراتينية طبقية ، مدعومة بكبسولة من النسيج الضام تحتوي على الأوعية الدموية والأعصاب واللمفية ، مما يوفر سهولة الوصول إلى الخلايا المناعية11،12. وعلاوة على ذلك، استئصال اللوزتين، وهو الفعل الجراحي لإزالة اللوزتين، هو إجراء شائع يتم إجراؤه على الأطفال الذين يعانون من اضطراب في التنفس، مما يجعل اللوزتين نسيجًا متاحًا بسهولة13 في البيئات الفسيولوجية.
اللوزتين تسمح بدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. في الواقع، في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، لأن اللوزتين تتكون من تركيز عال من الخلايا المناعية، فهي الهدف الرئيسي للتكاثر الفيروسي ولكن أيضا إنتاج كمية كبيرة من السيتوكينات التي لم يتم الكشف عنها في الدورة الدموية14،15. في الولايات ثابتة, نادرة السّكان من فطريّة مثل خلايا حاضرة في مختلفة نسيج مخاطيّ, بما في ذلك اللوزتين, غير أنّ أساسيّا غائبة من دم.
وهكذا، فإن الخلايا أحادية النواة من اللوزتين هي نموذج أكثر أهمية وتعقيداً من الخلايا PBMCs ويمكن أن تجيب على أسئلة أكثر عمقاً. من ناحية أخرى، يمكن استخدام explants الأنسجة تكون معقدة وغير ذات الصلة دائما إلى الدراسات المناعية الفطرية. وهكذا، أنشأنا نموذجا لدراسة تنشيط المناعة المخاطية باستخدام TMCs16. ونصف هنا طريقة لعزل الشركات عبر الأراضي الممَعَرَفَة بشكل فعّال عن اللوزتين البشريتين الطازجتين. هذه الطريقة تسمح باستعادة عدد كبير من الخلايا المناعية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات في الجسم الحي السابق.
Protocol
Representative Results
Discussion
اللوزتين البشرية تمثل نموذج فيزيولوجي السابقين فيزيولوجية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية في واجهة المخاطية، لأنها تحاكي دور الجهاز اللمفاوي الثانوي. ومن المثير للاهتمام أن التركيب الخلوي للبلدان عبر التخصصات الإقليمية يشبه مراكز PBMCs ويشمل جميع مجموعات الخلايا الرئيسية، على الرغم …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل الوكالة الوطنية لمراقبة التنمية في منطقة سيدا وهرهبات ANRS (J-P. ح) للتجارب وN.B. زمالة (AAP 2017 166). تعترف N.S. بالدعم المقدم من ANRS للحصول على الزمالة (AAP 2016 1)، والمنظمة الأوروبية لبيولوجيا الجزيئية EMBO للزمالة (LT 834 2017)، وبرنامج تمويل الشركات الناشئة “باوشتاين” من كلية الطب في جامعة أولم (LSBN.0147) وDFG دويتشه Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
Referências
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
