测量在C.elegan的RAN肽毒性
Summary
重复相关非ATG相关转化产品是几种重复扩张性疾病的病原特征。所述协议的目的是使用模型系统C.elegans的行为和细胞测定来评估这些肽引起的毒性。
Abstract
C. elegans通常用于模拟由重复扩张突变引起的与年龄相关的神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 和亨廷顿舞蹈症。最近，含有重复膨胀的RNA被证明是一种新型蛋白质翻译的基质，称为重复相关非AUG依赖性（RAN）翻译。与规范翻译不同，RAN 翻译不需要启动协和，并且仅在重复超过阈值长度时发生。由于没有开始协理来确定读取帧，RAN 翻译出现在包含重复扩展序列的感知和反感觉 RNA 模板的所有读取帧中。因此，RAN 翻译将可能的疾病相关有毒肽的数量从 1 扩展到 6。到目前为止，RAN翻译已经记录在八种不同的重复扩张为基础的神经退行性疾病和神经肌肉疾病。在每种情况下，破译哪些RAN产品是有毒的，以及它们的毒性机制，是了解这些肽如何促进疾病病理生理学的关键步骤。本文提出了在模型系统C.elegans中测量RAN肽毒性的策略。首先，我们描述了测量RAN肽毒性的程序，对发育的C.elegans的生长和活力。其次，我们详细介绍了一种用于测量RAN肽在运动性上发育后、年龄依赖作用的测定方法。最后，我们描述了一种神经毒性测定，用于评估RAN肽对神经元形态的影响。这些测定提供了RAN肽毒性的广泛评估，可用于执行大规模遗传或小分子屏幕，以确定疾病机制或疗法。
Introduction
DNA重复序列的不当扩展是几种神经退行性疾病的遗传基础，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、前额痴呆症（FTD）和亨廷顿舞蹈症（HD）1。虽然这些疾病已建立细胞和动物模型，但这些条件背后的机制没有明确界定。例如，HD 是由亨廷顿蛋白 Htt2的编码序列中 CAG 重复序列的扩展引起的。由于CAG编码氨基酸谷氨酰胺，CAG重复膨胀导致在Htt内插入多谷氨酰胺或聚Q序列。 膨胀的聚Q蛋白形成长度和年龄相关蛋白聚合体，与毒性33，44相关。令人惊讶的是，最近的两项研究表明，聚Q序列的长度不是导致HD疾病发病的主要原因，这表明与多Q无关的因素也可能导致这种疾病55，6。6
一种可能的聚Q无关机制涉及一种新发现的蛋白质翻译类型，称为Repeat A分离N对AUG依赖（RAN）翻译7。顾名思义，RAN 翻译仅在存在扩展重复序列且不需要规范启动子序时发生。因此，RAN转换发生在重复的所有三个读取帧中，以产生三个不同的多肽。此外，由于许多基因还产生一个反感觉转录，其中包含扩展重复序列的反向补充，RAN翻译也发生在反意义笔录的所有三个阅读帧中。RAN 翻译共同将从扩大的含重复性 DNA 序列中产生的蛋白质数量从一个肽扩展到六种肽。迄今为止，RAN翻译已经观察到至少8个不同的重复膨胀障碍8。RAN肽在验尸病人样本中观察到，并且仅在患者进行扩大的重复99，1010的情况下。虽然这些肽在患者细胞中明显存在，但它们对疾病病理生理学的贡献尚不清楚。
为了更好地确定与RAN肽相关的潜在毒性，几个小组在各种模型系统中表示每种肽，如酵母、苍蝇、小鼠和组织培养细胞11、12、13、14、15、16。11,12,13,14,15,16这些模型没有利用重复序列进行表达，而是采用一种共变法，即消除重复序列，但保留氨基酸序列。翻译启动通过规范的ATG发生，肽通常融合到N-或C-terminus的荧光蛋白，这两种蛋白质似乎都不会干扰RAN肽的毒性。因此，每个构造都过度表示单个 RAN 肽。通过简单的测定对多细胞生物体中不同的RAN产品进行建模，以测量RAN肽毒性，对于了解不同RAN产品从每个致病的重复扩张如何导致细胞功能障碍和神经退化至关重要。
与其他模型系统一样，C. elegans提供了一个灵活而高效的实验平台，能够研究新的疾病机制，如 RAN 肽毒性。蠕虫提供了几种独特的实验属性，目前在其他RAN肽毒性模型中不可用。首先，从出生到死亡，C.elegans在光学上是透明的。这允许对RAN肽表达和定位进行简单的可视化，以及活体动物神经退化的体内分析。其次，生成RAN肽表达模型的转基因方法价格低廉，速度快。鉴于C.elegans的短三天生命周期，在一周内可以产生稳定转基因线，以细胞型特定的方式表达任何给定的RAN肽。第三，简单的表皮输出可以与基因筛选方法相结合，如化学诱变或RNAi筛选，以快速识别RAN肽毒性所必需的基因。最后，C. elegans的短寿命（+20天）使研究者能够确定衰老，这是大多数重复扩张性疾病的最大危险因素，如何影响RAN肽毒性。这种实验属性的组合在任何其他模型系统中都是无可比拟的，为RAN肽毒性的研究提供了一个强大的平台。
在这里，我们描述了几个测定，利用C.elegans的实验优势来测量RAN肽的毒性，并确定这种毒性的基因修饰剂。Codon-uns-ATG启动的RAN肽被标记与GFP，并在肌-3启动器下的肌肉细胞或非c-47启动子作用器下的GABAergic运动神经元中单独表达。对于肌肉细胞的表达，重要的是有毒的RAN肽被标记绿色荧光蛋白（GFP），或其他荧光蛋白（FP）标签，可以针对RNAi喂养载体。这是因为有毒的RAN肽表达通常阻止生长，使这种菌株不可行。使用gfp（RNAi）有条件地不激活RAN肽表达，并允许菌株维持，遗传交叉等。对于检测，这些动物从gfp（RNAi）中去除，这允许表达RAN肽和由此产生的表型。除了设计Codon-变型RAN肽表达构造的分子策略外，我们还描述了用于测量发育毒性（幼虫运动和生长测定）、发育后年龄相关毒性（麻痹测定）和神经元形态缺陷（共性测定）的测定。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们报告的方法，可用于测定RAN肽毒性建模在肌肉或神经元的C.elegans。虽然神经退行性蛋白质在人类患者中具有年龄发病表型，但在模型系统中过度表达时，它们也会表现出发育毒性。过度表达有显著的解释性限制，但它也为基因或药理学屏幕提供了一个强有力的起点，旨在识别能够逆转有毒表型的基因或药物。这一点尤其重要，因为大多数精确的动物疾病模型要么没有表型，要?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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