Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans
Summary
Los productos traslacionales no dependientes del ATG asociados a la repetición son características patógenas emergentes de varias enfermedades basadas en la expansión repetida. El objetivo del protocolo descrito es evaluar la toxicidad causada por estos péptidos utilizando ensayos conductuales y celulares en el sistema modelo C. elegans.
Abstract
C. elegans se utiliza comúnmente para modelar enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad causadas por mutaciones de expansión repetidas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Huntington. Recientemente, se demostró que el ARN que contiene expansión repetida es el sustrato de un tipo novedoso de traducción proteica llamada traducción no dependiente de la AUG (RAN) asociada a la repetición. A diferencia de la traducción canónica, la traducción RAN no requiere un codón de inicio y solo se produce cuando las repeticiones superan una longitud de umbral. Debido a que no hay codón de inicio para determinar el marco de lectura, la traducción RAN se produce en todos los marcos de lectura de las plantillas de ARN de detección y antisentido que contienen una secuencia de expansión repetida. Por lo tanto, la traducción DERAN amplía el número de posibles péptidos tóxicos asociados a la enfermedad de uno a seis. Hasta ahora, la traducción RAN se ha documentado en ocho diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares basadas en la expansión. En cada caso, descifrar qué productos RAN son tóxicos, así como sus mecanismos de toxicidad, es un paso crítico hacia la comprensión de cómo estos péptidos contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad. En este artículo, presentamos estrategias para medir la toxicidad de los péptidos RAN en el sistema modelo C. elegans. En primer lugar, describimos los procedimientos para medir la toxicidad del péptido RAN en el crecimiento y la motilidad del desarrollo de C. elegans. En segundo lugar, detallamos un ensayo para medir los efectos post-desarrollo y dependientes de la edad de los péptidos RAN en la motilidad. Por último, describimos un ensayo de neurotoxicidad para evaluar los efectos de los péptidos RAN en la morfología de las neuronas. Estos ensayos proporcionan una evaluación amplia de la toxicidad de los péptidos RAN y pueden ser útiles para realizar pantallas genéticas o pequeñas moléculas a gran escala para identificar mecanismos o terapias de la enfermedad.
Introduction
La expansión inapropiada de las secuencias de repetición de ADN es la base genética de varias enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y la enfermedad de Huntington (EH)1. Si bien existen modelos celulares y animales establecidos para estas enfermedades, los mecanismos subyacentes a estas condiciones no están bien definidos. Por ejemplo, la EH es causada por las expansiones de una secuencia de repetición CAG en la secuencia de codificación de la proteína Huntingtin Htt2. Debido a que CAG codifica el aminoácido glutamina, la expansión de repetición CAG da como resultado la inserción de una secuencia de poliglutamina, o polyQ, dentro de Htt. Las proteínas poliQ expandidas forman agregados proteicos dependientes de la longitud y la edad que están asociados con la toxicidad3,4. Sorprendentemente, dos estudios recientes sugieren que la longitud de la secuencia polyQ no es el principal impulsor de la aparición de la enfermedad de EH, lo que sugiere que los factores independientes del poliQ también pueden contribuir a la enfermedad5,,6.
Un posible mecanismo independiente de la poliQ implica un tipo recién descubierto de traducción de proteínas denominado Repeat Associado Non-AUG-dependiente (RAN) traducción7. Como su nombre indica, la traducción RAN sólo se produce cuando una secuencia de repetición expandida está presente y no requiere un codón de inicio canónico. Por lo tanto, la traducción RAN se produce en los tres marcos de lectura de la repetición para producir tres polipéptidos distintos. Además, debido a que muchos genes también producen una transcripción antisentido que contiene el complemento inverso de la secuencia de repetición expandida, la traducción RAN también se produce en los tres marcos de lectura de la transcripción antisentido. Juntos, la traducción RAN amplía el número de proteínas producidas a partir de una secuencia de ADN repetitiva ampliada de un péptido a seis péptidos. Hasta la fecha, la traducción RAN se ha observado en al menos ocho diferentes trastornos de expansión de repetición8. Los péptidos RAN se observan en muestras de pacientes postmortem y sólo en los casos en que el paciente lleva una repetición ampliada9,,10. Si bien estos péptidos están claramente presentes en las células del paciente, su contribución a la fisiopatología de la enfermedad no está clara.
Para definir mejor la toxicidad potencial asociada con los péptidos RAN, varios grupos han expresado cada péptido en varios sistemas modelo, tales como levadura, moscas, ratones, y células de cultivo de tejido11,12,13,14,15,16. En lugar de utilizar la secuencia de repetición para la expresión, estos modelos emplean un enfoque de codón-variación en el que se elimina la secuencia de repetición pero se conserva la secuencia de aminoácidos. La iniciación de la traducción se produce a través de un ATG canónico y el péptido se fusiona típicamente con una proteína fluorescente en la Terminal N o C, ninguno de los cuales parece interferir con la toxicidad del péptido RAN. Por lo tanto, cada construcción sobreexpresa un solo péptido RAN. Modelar los diferentes productos RAN en un organismo multicelular con ensayos simples para medir la toxicidad del péptido RAN es de vital importancia para entender cómo los diferentes productos RAN de cada expansión repetida causante de enfermedad contribuyen a la disfunción celular y la neurodegeneración.
Al igual que otros sistemas modelo, C. elegans proporciona una plataforma experimental flexible y eficiente que permite estudiar nuevos mecanismos de enfermedad, como la toxicidad de péptidos RAN. Los gusanos ofrecen varios atributos experimentales únicos que actualmente no están disponibles en otros modelos de toxicidad por péptidos RAN. En primer lugar, los C. elegans son ópticamente transparentes desde su nacimiento hasta la muerte. Esto permite una visualización sencilla de la expresión y localización del péptido RAN, así como el análisis in vivo de la neurodegeneración en animales vivos. En segundo lugar, los métodos transgénicos para generar modelos de expresión de péptidos RAN son baratos y rápidos. Dado el corto ciclo de vida de tres días de C. elegans,se pueden producir líneas transgénicas estables que expresan cualquier péptido RAN dado de una manera específica de tipo celular en menos de una semana. En tercer lugar, las salidas fenotípicas simples se pueden combinar con métodos de cribado genéticos, como mutagénesis química o cribado de ARNi, para identificar rápidamente genes esenciales para la toxicidad del péptido RAN. Por último, la corta vida útil de C. elegans (20 días) permite a los investigadores determinar cómo el envejecimiento, que es el mayor factor de riesgo para la mayoría de las enfermedades de expansión repetida, influye en la toxicidad del péptido RAN. Juntos, esta combinación de atributos experimentales es inigualable en cualquier otro sistema de modelos y ofrece una potente plataforma para el estudio de la toxicidad del péptido RAN.
Aquí describimos varios ensayos que aprovechan las ventajas experimentales de C. elegans para medir la toxicidad de los péptidos RAN e identificar modificadores genéticos de esta toxicidad. Los péptidos RAN iniciados por ATG con codón se etiquetan con GFP y se expresan individualmente en cualquiera de las células musculares bajo el promotor myo-3 o en las neuronas motoras GABAérgicas bajo el promotor unc-47. Para la expresión en las células musculares, es importante que los péptidos RAN tóxicos se etiqueten con proteína fluorescente verde (GFP), u otra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que se puede atacar con un vector de alimentación de ARNi. Esto se debe a que la expresión tóxica del péptido RAN generalmente bloquea el crecimiento, haciendo que tales cepas no sean viables. El uso de gfp(RNAi) inactiva condicionalmente la expresión del péptido RAN y permite el mantenimiento de cepas, cruces genéticos, etc. Para los ensayos, estos animales se eliminan de gfp (RNAi),lo que permite la expresión del péptido RAN y los fenotipos resultantes. Además de la estrategia molecular para diseñar construcciones de expresión de péptidos RAN variadas con codón, describimos ensayos para medir la toxicidad del desarrollo (motilidad larval y ensayo de crecimiento), toxicidad asociada a la edad post-desarrollo (ensayo de parálisis) y defectos morfológicos de las neuronas (ensayo de coordinación).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí informamos métodos que se pueden utilizar para analizar la toxicidad del péptido RAN modelado en el músculo o en las neuronas de C. elegans. Mientras que las proteínas neurodegenerativas tienen un fenotipo de inicio de edad en pacientes humanos, también pueden exhibir toxicidad en el desarrollo cuando se sobreexpresan en los sistemas modelo. La sobreexpresión tiene limitaciones interpretativas significativas, pero también proporciona un poderoso punto de partida para las pantallas genéticas o farma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
Referências
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