C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定
Summary
反復関連非ATG依存的翻訳産物は、いくつかの繰り返し拡張ベースの疾患の新たな病原性特徴である。記載されたプロトコルの目的は、モデル系C.elegansにおける行動および細胞アッセイを用いてこれらのペプチドによって引き起こされる毒性を評価することである。
Abstract
C.エレガンスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やハンチントン病などの繰り返し膨張突然変異によって引き起こされる、年齢関連神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。近年、反復膨張含有RNAは、反復関連非AUG依存性(RAN)翻訳と呼ばれる新規型のタンパク質翻訳の基質であることが示された。正規翻訳とは異なり、RAN変換は開始コドンを必要とせず、繰り返しがしきい値の長さを超えた場合にのみ発生します。読み取りフレームを決定する開始コドンがないため、RAN変換は、反復膨張シーケンスを含むセンスおよびアンチセンスRNAテンプレートの両方からすべての読み取りフレームで発生します。したがって、RAN翻訳は、疾患関連の有毒ペプチドの数を1から6に拡大する。これまで、RAN翻訳は、8つの異なる反復拡張ベースの神経変性疾患および神経筋疾患で文書化されてきた。いずれの場合も、どのRAN製品が毒性であるか、ならびに毒性のメカニズムを解読することは、これらのペプチドが疾患病態生理学にどのように寄与するかを理解するための重要なステップです。本論文では、モデル系C.エレガンスにおけるRANペプチドの毒性を測定する戦略を紹介する。まず、開発中のC.エレガンスの成長と運動性に関するRANペプチド毒性を測定する手順を説明する。第2に、RANペプチドが運動性に及ぼす、発達後の年齢依存性の影響を測定するためのアッセイを詳述する。最後に、ニューロンの形態に対するRANペプチドの効果を評価するための神経毒性アッセイについて述べます。これらのアッセイは、RANペプチド毒性の広範な評価を提供し、疾患のメカニズムまたは治療法を同定するために大規模な遺伝的または低分子スクリーンを実行するのに有用であり得る。
Introduction
DNA反復配列の不適切な拡大は筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病(HD)1などのいくつかの神経変性疾患の遺伝的基盤である。これらの疾患には確立された細胞モデルと動物モデルがあるが、これらの条件の根底にあるメカニズムは十分に定義されていない。例えば、HDは、ハンチンチンタンパク質Htt2に対するコード配列におけるCAG反復配列の拡張によって引き起こされる。CAGはアミノ酸グルタミンをコードするので、CAGの繰り返し拡張は、ポリグルタミン、またはポリQ内の配列を挿入する結果、Tt.拡張されたポリQタンパク質の中で、毒性33、44に関連する長さと年齢依存性タンパク質凝集体を形成する。驚くべきことに、2つの最近の研究は、polyQ配列の長さがHD疾患発症の主な要因ではないことを示唆し、ポリQ独立因子も疾患55、66に寄与する可能性があることを示唆している。
可能なポリQ非依存のメカニズムの1つは、Repeat Aon-AUG依存(RAN)翻訳7と呼ぶ新たに発見されたタイプのタンパク質翻訳を含む。その名前が示すように、RAN変換は、拡張された繰り返しシーケンスが存在し、正規開始コドンを必要としない場合にのみ発生します。したがって、RAN変換は、3つの異なるポリペプチドを産生する繰り返しの3つの読み取りフレームすべてに起こる。また、多くの遺伝子が、拡大された反復配列の逆補体を含むアンチセンス転写産物を産生するので、アンチセンス転写物の3つの読み取りフレームにおいてもRAN変換が起こる。RANの翻訳は、1つのペプチドから6つのペプチドに拡大された反復含有DNA配列から産生されるタンパク質の数を拡大する。現在までに、RAN翻訳は少なくとも8つの異なる反復拡張障害8において観察されている。RANペプチドは、死後の患者サンプルにおいて観察され、患者が拡大された繰り返し99、1010を運ぶ場合にのみ観察される。これらのペプチドは患者細胞に明らかに存在するが、疾患病態生理学への寄与は不明である。
RANペプチドに関連する潜在的な毒性をより良く定義するために、いくつかのグループは、酵母、ハエ、マウス、および組織培養細胞,11、12、13、14、15、16,12,13,14などの様々なモデルシステムで各ペプチド15を16発現している。これらのモデルは、発現に繰り返し配列を利用するのではなく、反復配列が除去されるがアミノ酸配列が保存されるコドン変動アプローチを採用している。翻訳開始は正規ATGを介して起こり、ペプチドは通常、N末端またはC末端の蛍光タンパク質に融合し、いずれもRANペプチド毒性を妨げているようには見えなくなる。したがって、各コンストラクトは単一のRANペプチドを過剰発現する。多細胞生物の異なるRAN製品を、RANペプチド毒性を測定する簡単なアッセイでモデリングすることは、各疾患を引き起こす反復膨張とは異なるRAN製品が細胞機能障害や神経変性にどのように寄与するかを理解するために極めて重要です。
他のモデルシステムと同様に、C.elegansは、RANペプチド毒性などの新しい疾患メカニズムの研究を可能にする柔軟で効率的な実験プラットフォームを提供します。ワームは、RANペプチド毒性の他のモデルでは現在利用できないいくつかのユニークな実験的属性を提供します。第一に、C.エレガンスは生まれてから死ぬまで光学的に透明である。これにより、RANペプチド発現と局在化の簡単な可視化、ならびに生きた動物における神経変性のインビボ分析が可能になります。第2に、RANペプチド発現モデルを生成するためのトランスジェニック方法は、安価で高速である。C.エレガンスの短い3日間のライフサイクルを考えると、細胞型特異的な方法で任意のRANペプチドを発現する安定したトランスジェニックラインは、1週間以内に生成することができる。第三に、単純な表現型の出力は、化学変異誘発またはRNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニング方法と組み合わせて、RANペプチド毒性に不可欠な遺伝子を迅速に同定することができる。最後に、C.エレガンスの短い寿命(〜20日)は、ほとんどの繰り返し拡張疾患の最大の危険因子である老化がRANペプチド毒性にどのように影響するかを決定することを可能にする。一緒に、実験属性のこの組み合わせは、他のモデルシステムでは比類のない、RANペプチド毒性の研究のための強力なプラットフォームを提供しています。
ここでは、C.エレガンスの実験的利点を利用して、RANペプチドの毒性を測定し、この毒性の遺伝的修飾因子を同定するいくつかのアッセイについて説明する。コドン変化したATG開始RANペプチドはGFPでタグ付けされ、myo-3プロモーターの下の筋肉細胞またはUNC-47プロモーターの下のGABAergic運動ニューロンのいずれかで個別に発現する。筋肉細胞の発現に関しては、毒性のRANペプチドが緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはRNAiの摂食ベクターで標的とすることができる他の蛍光タンパク質(FP)タグでタグ付けされることが重要です。これは、毒性RANペプチド発現が通常増殖を妨げ、そのような株を生存不可能にするためである。gfp(RNAi)の使用は、条件付きでRANペプチド発現を不活性化し、ひずみの維持、遺伝的十字架などを可能にします。アッセイの場合、これらの動物は、RANペプチドの発現と結果の表現型を可能にするgfp(RNAi)から除去される。コドン多様なRANペプチド発現構築物を設計するための分子戦略に加えて、発生毒性(幼虫運動性および成長アッセイ)、発生後の年齢関連毒性(麻痺アッセイ)、およびニューロン形態異常(コミュニケールアッセイ)を測定するためのアッセイについて述べています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、筋肉またはC.エレガンスのニューロンでモデル化されたRANペプチド毒性をアッセイするために使用できる方法を報告します。神経変性タンパク質はヒト患者に発症する表現型の年齢を有する一方で、モデル系で過剰発現すると発達毒性を示すこともある。過剰発現には解釈上の限界は大きいが、毒性表現型を逆転させる遺伝子や薬物の同定を目的とした遺伝的または薬理学?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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