Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans
Summary
I prodotti traslazionali non dipendenti dall’ATG sono caratteristiche patogene emergenti di diverse malattie basate sull’espansione delle ripetizioni. L’obiettivo del protocollo descritto è quello di valutare la tossicità causata da questi peptidi utilizzando saggi comportamentali e cellulari nel sistema modello C. elegans.
Abstract
C. elegans è comunemente usato per modellare malattie neurodegenerative legate all’età causate da mutazioni di espansione ripetute, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia di Huntington. Recentemente, l’RNA che lo contiene espansione ripetuta è il substrato per un nuovo tipo di traduzione di proteine chiamato traduzione non dipendente da AUG (RAN) associata alla ripetizione. A differenza della traduzione canonica, la conversione RAN non richiede un codone iniziale e si verifica solo quando le ripetizioni superano una lunghezza di soglia. Poiché non esiste un codone iniziale per determinare il fotogramma di lettura, la traduzione RAN si verifica in tutti i fotogrammi di lettura da modelli di RNA di senso e antisenso che contengono una sequenza di espansione di ripetizione. Pertanto, la traduzione RAN espande il numero di possibili peptidi tossici associati alla malattia da uno a sei. Finora, la traduzione RAN è stata documentata in otto diverse malattie neurodegenerative e neuromuscolari basate sull’espansione delle ripetizioni. In ogni caso, decifrare quali prodotti RAN sono tossici, così come i loro meccanismi di tossicità, è un passo fondamentale per capire come questi peptidi contribuiscono alla fisiopatologia della malattia. In questo articolo, presentiamo strategie per misurare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema modello C. elegans. In primo luogo, descriviamo le procedure per misurare la tossicità dei peptidi RAN sulla crescita e la motilità dello sviluppo di C. elegans. In secondo luogo, abbiamo dettagliato un saggio per misurare gli effetti post-sviluppo dipendenti dall’età dei peptidi RAN sulla motilità. Infine, descriviamo un saggio di neurotossicità per valutare gli effetti dei peptidi RAN sulla morfologia dei neuroni. Questi saggi forniscono un’ampia valutazione della tossicità dei peptidi RAN e possono essere utili per l’esecuzione di schermi genetici o di piccole molecole su larga scala per identificare meccanismi o terapie della malattia.
Introduction
L’espansione inappropriata delle sequenze di ripetizione del DNA è la base genetica di diverse malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e la malattia di Huntington (HD)1. Sebbene esistano modelli cellulari e animali consolidati per queste malattie, i meccanismi alla base di queste condizioni non sono ben definiti. Ad esempio, l’HD è causato dalle espansioni di una sequenza di ripetizione CAG nella sequenza di codifica per la proteina Huntingtina Htt2. Poiché CAG codifica la glutammina degli amminoacidi, l’espansione della ripetizione CAG comporta l’inserimento di una sequenza poliglutamina, o poliQ, all’interno di Htt. Proteine polyQ espanse formano aggregati proteici di lunghezza e di età associati alla tossicità3,4. Sorprendentemente, due studi recenti suggeriscono che la lunghezza della sequenza poliQ non è il principale fattore di insorgenza della malattia MH, suggerendo che anche fattori indipendenti dal poliq possono contribuire alla malattia5,6.
Un possibile meccanismo indipendente dal poliQ prevede un tipo di traduzione di proteine appena scoperto chiamato Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduzione7. Come suggerisce il nome, la traduzione RAN si verifica solo quando è presente una sequenza di ripetizione espansa e non richiede un codon di inizio canonico. Pertanto, la traduzione RAN avviene in tutti e tre i fotogrammi di lettura della ripetizione per produrre tre polipeptidi distinti. Inoltre, poiché molti geni producono anche una trascrizione antisenso che contiene il complemento inverso della sequenza di ripetizione espansa, la traduzione RAN si verifica anche in tutti e tre i fotogrammi di lettura della trascrizione antisenso. Insieme, la traduzione RAN espande il numero di proteine prodotte da una sequenza di DNA espansa contenente ripetizioni da un peptide a sei peptidi. Ad oggi, la traduzione ran è stata osservata in almeno otto diversi disturbi di espansione ripetuta8. I peptidi RAN sono osservati nei campioni di pazienti postmortem e solo nei casi in cui il paziente porta una ripetizione espansa9,10. Mentre questi peptidi sono chiaramente presenti nelle cellule del paziente, il loro contributo alla fisiopatologia della malattia non è chiaro.
Per definire meglio la potenziale tossicità associata ai peptidi RAN, diversi gruppi hanno espresso ogni peptide in vari sistemi modello, come lieviti, mosche, topi e cellule di coltura dei tessuti11,12,13,1414,15,16. Anziché utilizzare la sequenza di ripetizione per l’espressione, questi modelli utilizzano un approccio di variazione codon in cui la sequenza di ripetizione viene eliminata ma la sequenza di amminoacidi viene mantenuta. L’avvio della traduzione avviene attraverso un ATG canonico e il peptide è tipicamente fuso in una proteina fluorescente al Capon o Al C, nessuno dei quali sembra interferire con la tossicità del peptide RAN. Pertanto, ogni costrutto sovraesprime un singolo peptide RAN. Modellare i diversi prodotti RAN in un organismo multicellulare con semplici saggi per misurare la tossicità dei peptidi RAN è di vitale importanza per capire come i diversi prodotti RAN da ogni espansione di ripetizione che causa la malattia contribuiscono alla disfunzione cellulare e alla neurodegenerazione.
Come altri sistemi modello, C. elegans fornisce una piattaforma sperimentale flessibile ed efficiente che consente di studi su nuovi meccanismi di malattia, come la tossicità dei peptidi RAN. I vermi offrono diversi attributi sperimentali unici che non sono attualmente disponibili in altri modelli di tossicità peptide RAN. In primo luogo, C. elegans sono otticamente trasparenti dalla nascita alla morte. Ciò consente una semplice visualizzazione dell’espressione e localizzazione dei peptidi RAN, nonché l’analisi in vivo della neurodegenerazione negli animali vivi. In secondo luogo, i metodi transgenici per la generazione di modelli di espressione peptide RAN sono economici e veloci. Dato il breve ciclo di vita di tre giorni di C. elegans,linee transgeniche stabili che esprimono qualsiasi peptide RAN in modo specifico di tipo cellulare possono essere prodotte in meno di una settimana. In terzo luogo, semplici risultati fenotipici possono essere combinati con metodi di screening genetico, come la mutagenesi chimica o lo screening RNAi, per identificare rapidamente i geni essenziali per la tossicità dei peptidi RAN. Infine, la breve durata di vita di C. elegans (20 giorni) consente agli sperimentatori di determinare come l’invecchiamento, che è il più grande fattore di rischio per la maggior parte delle malattie di espansione ripetute, influenza la tossicità dei peptidi RAN. Insieme, questa combinazione di attributi sperimentali non ha eguali in qualsiasi altro sistema di modelli e offre una potente piattaforma per lo studio della tossicità dei peptidi RAN.
Qui descriviamo diversi saggi che sfruttano i vantaggi sperimentali di C. elegans per misurare la tossicità dei peptidi RAN e per identificare i modificatori genetici di questa tossicità. I peptidi RAN iniziati con codone sono etichettati con GFP ed espressi individualmente in cellule muscolari sotto il promotore di myo-3 o nei motoneuroni GABAergic sotto il promotore unc-47. Per l’espressione nelle cellule muscolari, è importante che i peptidi RAN tossici siano etichettati con proteine fluorescenti verdi (GFP) o altre proteine fluorescenti (FP) che possono essere mirate con un vettore di alimentazione RNAi. Questo perché l’espressione tossica del peptide RAN di solito blocca la crescita, rendendo tali ceppi non vitali. L’uso di gfp(RNAi) disattiva in modo condizionale l’espressione dei peptidi RAN e consente il mantenimento della deformazione, le croci genetiche, ecc. Per i saggi, questi animali vengono rimossi da gfp(RNAi), che consente l’espressione del peptide RAN e dei fenotipi risultanti. Oltre alla strategia molecolare per la progettazione di costrutti di espressione peptide RAN varia di codone, descriviamo i saggi per misurare la tossicità dello sviluppo (motilità larvale e test di crescita), la tossicità associata all’età post-sviluppo (analisi della paralisi) e i difetti morfologici del neurone (testare la commissure).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui riportiamo metodi che possono essere utilizzati per annotare la tossicità peptide RAN modellata nel muscolo o nei neuroni di C. elegans. Mentre le proteine neurodegenerative hanno un fenotipo inesoramento dell’età nei pazienti umani, possono anche mostrare tossicità dello sviluppo quando sovraespresse nei sistemi modello. La sovraespressione ha notevoli limitazioni interpretive, ma fornisce anche un potente punto di partenza per schermi genetici o farmacologici volti a identificare geni o farmaci in grado…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
Referências
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