Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Summary

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Abstract

Trotz seiner begrenzten analytischen Spezifität und Robustheit wurde der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) Assay weit verbreitet als generische Metrik der Lipidperoxidation in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Es wird oft als ein guter Indikator für den Grad des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen, vorausgesetzt, die Probe wurde ordnungsgemäß gehandhabt und gelagert. Der Assay beinhaltet die Reaktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd (MDA), mit Thiobarbitursäure (TBA), was zur Bildung von MDA-TBA2-Addukten namens TBARS führt. TBARS ergibt eine rot-rosa Farbe, die spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden kann. Der TBARS-Assay wird unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C durchgeführt. Reines MDA ist instabil, aber diese Bedingungen erlauben die Freisetzung von MDA aus MDA-Bis (Dimethylacetal), das als analytischer Standard in dieser Methode verwendet wird. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die in etwa 2 h abgeschlossen werden kann. Die Herstellung von Assay-Reagenzien wird hier ausführlich beschrieben. Budgetbewusste Forscher können diese Reagenzien für mehrere Experimente zu geringen Kosten verwenden, anstatt ein teures TBARS-Assay-Kit zu kaufen, das nur die Konstruktion einer einzigen Standardkurve erlaubt (und somit nur für ein Experiment verwendet werden kann). Die Anwendbarkeit dieses TBARS-Assays wird in humanem Serum, Lipoproteinen niedriger Dichte und Zelllysaten gezeigt. Der Assay ist konsistent und reproduzierbar, und es können Nachweisgrenzen von 1,1 μM erreicht werden. Es werden Empfehlungen für die Verwendung und Interpretation des spektralphotometrischen TBARS-Assays gegeben.

Introduction

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende ^{Sekundärprodukte1}.

MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe ^erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit ^TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von “Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen” oder TBARS5 betrachtet.

Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe ^angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.

Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)^14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse ^haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.

Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay ^{durchführt21,22}, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.

Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.

Protocol

Menschliche Serumproben wurden von einwilligenden Freiwilligen unter IRB-Zulassung und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Prinzipien erhalten. Die Proben wurden vor dem Transfer in das Analyselabor codiert und de-identifiziert. 1. Probenvorbereitung HepG2 Zelllysate Entkernen Sie etwa 10 x 106 HepG2-Zellen pro Kolben in 16 T75-Kolben mit 14 ml EMEM-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und züchten S…

Representative Results

Unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C ergibt Malondialdehyd (MDA) bis(dimethyl acetal) MDA23. MDA und eng verwandte chemische Kongenere reagieren mit zwei Molekülen Thiobarbitursäure (TBA), um Verbindungen zu produzieren, die als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet werden, die eine rot-rosa Farbe ergeben und eine Absorption λmax bei 532 nm aufweisen (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter Verwendun…

Discussion

Trotz seiner Einschränkungen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 und mangelnder Eignung für Vergleiche zwischen Laboratorien ist der TBARS-Assay einer der <…

Materials

1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642–262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells