Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

Summary

O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Abstract

Apesar de sua limitada especificidade analítica e robustez, o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido amplamente utilizado como uma métrica genérica de peroxidação lipídica em fluidos biológicos. É frequentemente considerado um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo dentro de uma amostra biológica, desde que a amostra tenha sido adequadamente manuseada e armazenada. O ensaio envolve a reação de produtos lipídicos de peroxidação, principalmente malondialdeído (MDA), com ácido tiobarbitúrico (TBA), o que leva à formação de adutos MDA-TBA2 chamados TBARS. O TBARS produz uma cor vermelho-rosa que pode ser medida espectrofotometricamente a 532 nm. O ensaio TBARS é realizado em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C. O MDA puro é instável, mas essas condições permitem a liberação de MDA de MDA bis (acetal de dimetila), que é usado como padrão analítico neste método. O ensaio TBARS é um método simples que pode ser concluído em cerca de 2 h. A preparação dos reagentes de ensaios são descritas em detalhes aqui. Pesquisadores conscientes do orçamento podem usar esses reagentes para experimentos múltiplos a um custo baixo em vez de comprar um kit de ensaio TBARS caro que só permite a construção de uma única curva padrão (e, portanto, só pode ser usado para um experimento). A aplicabilidade deste ensaio TBARS é mostrada em soro humano, lipoproteínas de baixa densidade e lises celulares. O ensaio é consistente e reprodutível, e os limites de detecção de 1,1 μM podem ser alcançados. Recomendações para o uso e interpretação do ensaio espectrofotométrico TBARS são fornecidas.

Introduction

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários ^{predominantes1}.

O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devido à sua reação fácil com ácido tiobarbitúrico (TBA). A reação leva à formação do MDA-TBA2, um conjugado que absorve no espectro visível a 532 nm e produz uma cor vermelho-rosa2. Outras moléculas derivadas da peroxidação lipídica além do MDA também podem reagir com TBA e absorver luz a 532 nm, contribuindo para o sinal de absorção global que é medido. Da mesma forma, o MDA pode reagir com a maioria das outras classes principais de biomoléculas, potencialmente limitando sua acessibilidade para reação com ^TBA3,4. Como tal, este ensaio tradicional é simplesmente considerado para medir “substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico” ou ^TBARS5.

Quando corretamente aplicado e interpretado, o ensaio TBARS é geralmente considerado um bom indicador dos níveis globais de estresse oxidativo em uma amostra ^biológica6. Infelizmente, como documentado por Khoubnasabjafari e outros, o ensaio TBARS é frequentemente conduzido e interpretado de maneiras que facilitam conclusões duvidosas3,4,7,8,9,10,11. As causas para isso estão enraizadas principalmente em variáveis pré-analíticas relacionadas à amostra e na falta de robustez de ensaios que proíbe variações aparentemente menores no protocolo de ensaio sem alterações substanciais nos resultados ^do ensaio1,7,12,13.

Variáveis pré-analíticas relacionadas ao manuseio e armazenamento de bioespecímen (por exemplo, o plasma de sangue mantido temporariamente a -20 °C)^14,15 podem ter um grande impacto nos resultados do ensaio TBARS16,17; tanto que os resultados do ensaio TBARS não devem ser comparados em diferentes laboratórios, a menos que seja justificado por dados explícitos de validação analítica interlaboratória. Esta recomendação é semelhante à forma como as manchas ocidentais são comumente usadas e interpretadas. Comparações de densidades de banda são válidas para estudos dentro da mancha e talvez dentro de laboratório, mas comparar densidades de banda entre laboratórios é geralmente considerado uma prática inválida.

Alguns pesquisadores sugeriram que o MDA medido pelo ensaio TBARS simplesmente não atende aos critérios analíticos ou clínicos exigidos de um biomarcador aceitável3,9,10,18,19. De fato, se o ensaio não tivesse sido desenvolvido há mais de 50 anos, provavelmente não teria ganho o uso generalizado e a aceitabilidade tácita que tem hoje. Embora existam outros ensaios com maior sensibilidade analítica, especificidade e robustez utilizadas para determinar o estresse oxidativo, o ensaio TBARS baseado na absorção a 532 nm permanece de longe um dos ensaios mais utilizados para a determinação da peroxidação ^lipídica20, e assim a avaliação do estresse oxidativo.

O ensaio TBARS só pode ser encontrado como um kit caro (mais de 400 dólares americanos), no qual as instruções não fornecem informações detalhadas sobre a maioria das concentrações dos reagentes utilizados. Além disso, os reagentes fornecidos só podem ser usados para um experimento, pois apenas uma curva padrão colorimétrica pode ser feita por kit. Isso pode ser problemático para pesquisadores que pretendem determinar níveis de oxidação dentro de algumas amostras em diferentes pontos de tempo, porque a mesma curva padrão não pode ser usada em vários momentos. Portanto, vários kits precisam ser comprados para vários experimentos. Atualmente, a menos que um kit caro seja comprado, não há um protocolo detalhado disponível para como realizar um ensaio TBARS. Alguns pesquisadores no passado descreveram vagamente como realizar um ensaio ^TBARS21,22, mas nem um protocolo totalmente detalhado ou um vídeo abrangente sobre como conduzir o ensaio TBARS sem um kit caro está disponível na literatura.

Aqui relatamos uma metodologia detalhada e analiticamente validada para fins sobre como realizar um ensaio TBARS de forma simples, reprodutível e barata. Alterações na peroxidação lipídica do soro humano, lisatos hepG2 e lipoproteínas de baixa densidade após o tratamento com íons cu(II) são demonstradas como aplicações ilustrativas para o ensaio TBARS. Os resultados demonstram que este ensaio TBARS é consistente e reproduzível no dia-a-dia.

Protocol

Os espécimes de soro humano foram obtidos de voluntários consentidos sob aprovação do IRB e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinque. Os espécimes foram codificados e desidentifilados antes da transferência para o laboratório analítico. 1. Preparação da amostra Lises celulares HepG2 Semente cerca de 10 x 106 células HepG2 por frasco em 16 frascos T75 com 14 mL de mídia EMEM complementadas com 10% de soro bov…

Representative Results

Em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C, o malondialdeído (MDA) bis (acetal de dimetila) produz MDA23. Os congêneres químicos relacionados com mDA e intimamente relacionados reagem com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para produzir compostos chamados substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dão uma cor vermelho-rosa e têm uma absorção λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando-s…

Discussion

Apesar de suas limitações1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e falta de adequação para comparação entre laboratórios, o ensaio do TBARS é um dos <sup…

Materials

1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642–262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells