Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico

Summary

L’obiettivo del test delle sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d’onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.

Abstract

Nonostante la sua limitata specificità analitica e robustezza, il saggio delle sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS) è stato ampiamente utilizzato come metrica generica della perossidazione lipidica nei fluidi biologici. È spesso considerato un buon indicatore dei livelli di stress ossidativo all’interno di un campione biologico, a condizione che il campione sia stato correttamente maneggiato e conservato. Il test prevede la reazione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide (MDA), con acido tiobarbiturico (TBA), che porta alla formazione di addotti MDA-TBA2 chiamati TBARS. TBARS produce un colore rosso-rosa che può essere misurato spettrofotometricamente a 532 nm. Il test TBARS viene eseguito in condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C. L’MDA puro è instabile, ma queste condizioni consentono il rilascio di MDA da MDA bis (dimetil acetale), che viene utilizzato come standard analitico in questo metodo. Il test TBARS è un metodo semplice che può essere completato in circa 2 ore. La preparazione dei reagenti di analisi è descritta in dettaglio qui. I ricercatori attenti al budget possono utilizzare questi reagenti per più esperimenti a basso costo piuttosto che acquistare un costoso kit di analisi TBARS che consente solo la costruzione di una singola curva standard (e quindi può essere utilizzato solo per un esperimento). L’applicabilità di questo test TBARS è dimostrata nel siero umano, nelle lipoproteine a bassa densità e nei lisati cellulari. Il test è coerente e riproducibile e possono essere raggiunti limiti di rilevazione di 1,1 μM. Vengono fornite raccomandazioni per l’uso e l’interpretazione del test spettrofotometrico TBARS.

Introduction

La perossidazione lipidica è un processo in cui i radicali liberi, come le specie reattive dell’ossigeno e le specie reattive dell’azoto, attaccano i doppi legami carbonio-carbonio nei lipidi, un processo che comporta l’estrazione di un idrogeno da un carbonio e l’inserimento di una molecola di ossigeno. Questo processo porta a una miscela di prodotti complessi tra cui radicali lipidici perossilici e idroperossidi come prodotti primari, nonché malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale come prodotti secondari ^{predominanti1}.

MDA è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore di perossidazione lipidica a causa della sua facile reazione con l’acido tiobarbiturico (TBA). La reazione porta alla formazione di MDA-TBA2, un coniugato che assorbe nello spettro visibile a 532 nm e produce un colore rosso-rosa2. Altre molecole derivate dalla perossidazione lipidica oltre all’MDA possono anche reagire con il TBA e assorbire la luce a 532 nm, contribuendo al segnale di assorbimento complessivo che viene misurato. Allo stesso modo, MDA può reagire con la maggior parte delle altre principali classi di biomolecole, limitando potenzialmente la sua accessibilità per la reazione con ^TBA3,4. Come tale, questo test tradizionale è semplicemente considerato per misurare “sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico” o ^TBARS5.

Se applicato e interpretato correttamente, il test TBARS è generalmente considerato un buon indicatore dei livelli complessivi di stress ossidativo in un campione ^biologico6. Sfortunatamente, come documentato da Khoubnasabjafari e altri, il test TBARS è spesso condotto e interpretato in modi che facilitano conclusioni dubbie3,4,7,8,9,10,11. Le cause di ciò sono radicate principalmente nelle variabili pre-analitiche correlate al campione e nella mancanza di robustezza del saggio che vieta variazioni apparentemente minori nel protocollo del saggio senza cambiamenti sostanziali nei risultati del test1,7,12,13.

Le variabili preanalitiche correlate alla manipolazione e alla conservazione dei biocampioni (ad esempio, plasma sanguigno mantenuto temporaneamente a -20 °C)^14,15 possono avere un impatto importante sui risultati del test TBARS16,17; tanto che i risultati del test TBARS non dovrebbero essere confrontati tra diversi laboratori a meno che non siano garantiti da espliciti dati di convalida analitica interlaboratorio. Questa raccomandazione è simile a come i western blots sono comunemente usati e interpretati. I confronti delle densità di banda sono validi per gli studi all’interno del blot e forse all’interno del laboratorio, ma il confronto delle densità di banda tra i laboratori è generalmente considerato una pratica non valida.

Alcuni ricercatori hanno suggerito che l’MDA misurato dal test TBARS semplicemente non soddisfa i criteri analitici o clinici richiesti da un biomarcatore accettabile3,9,10,18,19. Infatti, se il saggio non fosse stato sviluppato oltre 50 anni fa, probabilmente non avrebbe ottenuto l’uso diffuso e la tacita accettabilità che ha oggi. Sebbene esistano altri saggi con maggiore sensibilità analitica, specificità e robustezza utilizzati per determinare lo stress ossidativo, il saggio TBARS basato sull’assorbanza a 532 nm rimane di gran lunga uno dei saggi più comunemente usati per la determinazione della perossidazione ^lipidica20 e quindi la valutazione dello stress ossidativo.

Il test TBARS può essere trovato solo come un kit costoso (oltre 400 dollari USA), in cui le istruzioni non forniscono informazioni dettagliate sulla maggior parte delle concentrazioni dei reagenti utilizzati. Inoltre, i reagenti forniti possono essere utilizzati solo per un esperimento, perché è possibile realizzare una sola curva standard colorimetrica per kit. Questo può essere problematico per i ricercatori che intendono determinare i livelli di ossidazione all’interno di pochi campioni in diversi punti temporali, perché la stessa curva standard non può essere utilizzata più volte. Quindi, è necessario acquistare più kit per più esperimenti. Attualmente, a meno che non venga acquistato un kit costoso, non è disponibile un protocollo dettagliato su come eseguire un test TBARS. Alcuni ricercatori in passato hanno vagamente descritto come eseguire un test ^TBARS21,22, ma né un protocollo completamente dettagliato né un video completo su come condurre il test TBARS senza un kit costoso è disponibile in letteratura.

Qui riportiamo una metodologia dettagliata e convalidata analiticamente per lo scopo su come eseguire un test TBARS in modo semplice, riproducibile ed economico. I cambiamenti nella perossidazione lipidica del siero umano, dei lisati HepG2 e delle lipoproteine a bassa densità dopo il trattamento con ioni Cu(II) sono dimostrati come applicazioni illustrative per il test TBARS. I risultati dimostrano che questo test TBARS è coerente e riproducibile su base giornaliera.

Protocol

I campioni di siero umano sono stati ottenuti da volontari consenzienti sotto l’approvazione dell’IRB e secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. I campioni sono stati codificati e de-identificati prima del trasferimento al laboratorio di analisi. 1. Preparazione del campione Lisati di cellule HepG2 Semina circa 10 x 106 cellule HepG2 per pallone in 16 palloni T75 con 14 ml di emEM media integrati con il 10% di siero bovino fet…

Representative Results

In condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C, la malondialdeide (MDA) bis(dimetil acetale) produce MDA23. MDA e congeneri chimici strettamente correlati reagiscono con due molecole di acido tiobarbiturico (TBA) per produrre composti chiamati sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), che danno un colore rosso-rosa e hanno un λmax di assorbanza a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizzando MDA bis (dimetilacetale) come standa…

Discussion

Nonostante i suoi limiti1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e la mancanza di idoneità al confronto tra laboratori, il test TBARS è uno dei più <sup class=…

Materials

1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642–262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells