L’obiettivo del test delle sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d’onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.
Nonostante la sua limitata specificità analitica e robustezza, il saggio delle sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS) è stato ampiamente utilizzato come metrica generica della perossidazione lipidica nei fluidi biologici. È spesso considerato un buon indicatore dei livelli di stress ossidativo all’interno di un campione biologico, a condizione che il campione sia stato correttamente maneggiato e conservato. Il test prevede la reazione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide (MDA), con acido tiobarbiturico (TBA), che porta alla formazione di addotti MDA-TBA2 chiamati TBARS. TBARS produce un colore rosso-rosa che può essere misurato spettrofotometricamente a 532 nm. Il test TBARS viene eseguito in condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C. L’MDA puro è instabile, ma queste condizioni consentono il rilascio di MDA da MDA bis (dimetil acetale), che viene utilizzato come standard analitico in questo metodo. Il test TBARS è un metodo semplice che può essere completato in circa 2 ore. La preparazione dei reagenti di analisi è descritta in dettaglio qui. I ricercatori attenti al budget possono utilizzare questi reagenti per più esperimenti a basso costo piuttosto che acquistare un costoso kit di analisi TBARS che consente solo la costruzione di una singola curva standard (e quindi può essere utilizzato solo per un esperimento). L’applicabilità di questo test TBARS è dimostrata nel siero umano, nelle lipoproteine a bassa densità e nei lisati cellulari. Il test è coerente e riproducibile e possono essere raggiunti limiti di rilevazione di 1,1 μM. Vengono fornite raccomandazioni per l’uso e l’interpretazione del test spettrofotometrico TBARS.
La perossidazione lipidica è un processo in cui i radicali liberi, come le specie reattive dell’ossigeno e le specie reattive dell’azoto, attaccano i doppi legami carbonio-carbonio nei lipidi, un processo che comporta l’estrazione di un idrogeno da un carbonio e l’inserimento di una molecola di ossigeno. Questo processo porta a una miscela di prodotti complessi tra cui radicali lipidici perossilici e idroperossidi come prodotti primari, nonché malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale come prodotti secondari predominanti1.
MDA è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore di perossidazione lipidica a causa della sua facile reazione con l’acido tiobarbiturico (TBA). La reazione porta alla formazione di MDA-TBA2, un coniugato che assorbe nello spettro visibile a 532 nm e produce un colore rosso-rosa2. Altre molecole derivate dalla perossidazione lipidica oltre all’MDA possono anche reagire con il TBA e assorbire la luce a 532 nm, contribuendo al segnale di assorbimento complessivo che viene misurato. Allo stesso modo, MDA può reagire con la maggior parte delle altre principali classi di biomolecole, limitando potenzialmente la sua accessibilità per la reazione con TBA3,4. Come tale, questo test tradizionale è semplicemente considerato per misurare “sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico” o TBARS5.
Se applicato e interpretato correttamente, il test TBARS è generalmente considerato un buon indicatore dei livelli complessivi di stress ossidativo in un campione biologico6. Sfortunatamente, come documentato da Khoubnasabjafari e altri, il test TBARS è spesso condotto e interpretato in modi che facilitano conclusioni dubbie3,4,7,8,9,10,11. Le cause di ciò sono radicate principalmente nelle variabili pre-analitiche correlate al campione e nella mancanza di robustezza del saggio che vieta variazioni apparentemente minori nel protocollo del saggio senza cambiamenti sostanziali nei risultati del test1,7,12,13.
Le variabili preanalitiche correlate alla manipolazione e alla conservazione dei biocampioni (ad esempio, plasma sanguigno mantenuto temporaneamente a -20 °C)14,15 possono avere un impatto importante sui risultati del test TBARS16,17; tanto che i risultati del test TBARS non dovrebbero essere confrontati tra diversi laboratori a meno che non siano garantiti da espliciti dati di convalida analitica interlaboratorio. Questa raccomandazione è simile a come i western blots sono comunemente usati e interpretati. I confronti delle densità di banda sono validi per gli studi all’interno del blot e forse all’interno del laboratorio, ma il confronto delle densità di banda tra i laboratori è generalmente considerato una pratica non valida.
Alcuni ricercatori hanno suggerito che l’MDA misurato dal test TBARS semplicemente non soddisfa i criteri analitici o clinici richiesti da un biomarcatore accettabile3,9,10,18,19. Infatti, se il saggio non fosse stato sviluppato oltre 50 anni fa, probabilmente non avrebbe ottenuto l’uso diffuso e la tacita accettabilità che ha oggi. Sebbene esistano altri saggi con maggiore sensibilità analitica, specificità e robustezza utilizzati per determinare lo stress ossidativo, il saggio TBARS basato sull’assorbanza a 532 nm rimane di gran lunga uno dei saggi più comunemente usati per la determinazione della perossidazione lipidica20 e quindi la valutazione dello stress ossidativo.
Il test TBARS può essere trovato solo come un kit costoso (oltre 400 dollari USA), in cui le istruzioni non forniscono informazioni dettagliate sulla maggior parte delle concentrazioni dei reagenti utilizzati. Inoltre, i reagenti forniti possono essere utilizzati solo per un esperimento, perché è possibile realizzare una sola curva standard colorimetrica per kit. Questo può essere problematico per i ricercatori che intendono determinare i livelli di ossidazione all’interno di pochi campioni in diversi punti temporali, perché la stessa curva standard non può essere utilizzata più volte. Quindi, è necessario acquistare più kit per più esperimenti. Attualmente, a meno che non venga acquistato un kit costoso, non è disponibile un protocollo dettagliato su come eseguire un test TBARS. Alcuni ricercatori in passato hanno vagamente descritto come eseguire un test TBARS21,22, ma né un protocollo completamente dettagliato né un video completo su come condurre il test TBARS senza un kit costoso è disponibile in letteratura.
Qui riportiamo una metodologia dettagliata e convalidata analiticamente per lo scopo su come eseguire un test TBARS in modo semplice, riproducibile ed economico. I cambiamenti nella perossidazione lipidica del siero umano, dei lisati HepG2 e delle lipoproteine a bassa densità dopo il trattamento con ioni Cu(II) sono dimostrati come applicazioni illustrative per il test TBARS. I risultati dimostrano che questo test TBARS è coerente e riproducibile su base giornaliera.
Nonostante i suoi limiti1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e la mancanza di idoneità al confronto tra laboratori, il test TBARS è uno dei più <sup class=…
The authors have nothing to disclose.
La ricerca qui riportata è stata sostenuta in parte dal National Cancer Institute del National Institutes of Health sotto il premio no. R33 CA217702 e il programma IMSD (Initiative for Maximizing Student Development). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642–262 | cell lysis reagent |
50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |