Thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ परख का उपयोग कर जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव का मूल्यांकन
Summary
thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों परख का लक्ष्य लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों के उत्पादन को मापने के द्वारा जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन करने के लिए है, मुख्य रूप से malondialdehyde, 532 एनएम पर दृश्य तरंग दैर्ध्य spectrophotometry का उपयोग कर। यहां वर्णित विधि को मानव सीरम, सेल लिसेट और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
इसकी सीमित विश्लेषणात्मक विशिष्टता और बीहड़ता के बावजूद, थायोबार्बिट्यूरिक एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ (TBARS) परख व्यापक रूप से जैविक तरल पदार्थों में लिपिड पेरोक्सीडेशन के एक सामान्य मीट्रिक के रूप में उपयोग किया गया है। इसे अक्सर जैविक नमूने के भीतर ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर का एक अच्छा संकेतक माना जाता है, बशर्ते कि नमूने को ठीक से संभाला और संग्रहीत किया गया हो। परख में लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों की प्रतिक्रिया शामिल है, मुख्य रूप से मैलोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए), थायोबार्बिटुरिक एसिड (टीबीए) के साथ, जो टीबीएआरएस नामक एमडीए-टीबीए 2 एडक्ट्स के गठन की ओर जाता है। TBARS एक लाल-गुलाबी रंग उत्पन्न करता है जिसे 532 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जा सकता है। TBARS परख अम्लीय परिस्थितियों (पीएच = 4) और 95 डिग्री सेल्सियस पर के तहत किया जाता है। शुद्ध एमडीए अस्थिर है, लेकिन ये स्थितियां एमडीए बिस (डाइमिथाइल एसिटल) से एमडीए की रिहाई की अनुमति देती हैं, जिसका उपयोग इस विधि में विश्लेषणात्मक मानक के रूप में किया जाता है। TBARS परख एक सीधा तरीका है कि के बारे में 2 ज में पूरा किया जा सकता है. परख अभिकर्मकों की तैयारी यहाँ विस्तार से वर्णित कर रहे हैं. बजट-जागरूक शोधकर्ता इन अभिकर्मकों का उपयोग कम लागत पर कई प्रयोगों के लिए कर सकते हैं, बजाय एक महंगी TBARS परख किट खरीदने के जो केवल एक ही मानक वक्र के निर्माण की अनुमति देता है (और इस प्रकार केवल एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)। इस TBARS परख की प्रयोज्यता मानव सीरम, कम घनत्व लिपोप्रोटीन, और सेल lysates में दिखाया गया है. परख सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और 1.1 μM का पता लगाने की सीमा तक पहुँचा जा सकता है. उपयोग और spectrophotometric TBARS परख की व्याख्या के लिए सिफारिशें प्रदान की जाती हैं.
Introduction
लिपिड पेरोक्सीडेशन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें मुक्त कण, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियां, लिपिड में कार्बन-कार्बन डबल बॉन्ड पर हमला करती हैं, एक प्रक्रिया जिसमें कार्बन से हाइड्रोजन का अमूर्तन और ऑक्सीजन अणु का सम्मिलन शामिल होता है। यह प्रक्रिया जटिल उत्पादों के मिश्रण की ओर ले जाती है, जिसमें लिपिड पेरोक्सिल रेडिकल्स, और प्राथमिक उत्पादों के रूप में हाइड्रोपेरोक्साइड, साथ ही साथ मालोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए) और 4-हाइड्रॉक्सीनोनेल प्रमुख माध्यमिक उत्पादों के रूप में शामिल हैं।
एमडीए व्यापक रूप से थायोबार्बिट्यूरिक एसिड (टीबीए) के साथ इसकी सरल प्रतिक्रिया के कारण लिपिड पेरोक्सीडेशन के मार्कर के रूप में बायोमेडिकल अनुसंधान में उपयोग किया गया है। प्रतिक्रिया एमडीए-टीबीए 2 के गठन की ओर ले जाती है, एक संयुग्मी जो 532 एनएम पर दृश्यमान स्पेक्ट्रम में अवशोषित करता है और एक लाल-गुलाबी रंग 2 का उत्पादन करता है। एमडीए के अलावा लिपिड पेरोक्सीडेशन से प्राप्त अन्य अणु भी टीबीए के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और 532 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित कर सकते हैं, जो मापा जाने वाले समग्र अवशोषण संकेत में योगदान देते हैं। इसी तरह, एमडीए बायोमोलेक्यूल्स के अधिकांश अन्य प्रमुख वर्गों के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, संभावित रूप से टीबीए 3, 4 के साथ प्रतिक्रिया के लिए अपनी पहुंच को सीमित कर सकता है। जैसे, इस पारंपरिक परख बस “thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों” या TBARS5 को मापने के लिए माना जाता है।
जब सही ढंग से लागू किया और व्याख्या की, TBARS परख आम तौर पर एक जैविक नमूना 6 में ऑक्सीडेटिव तनाव के समग्र स्तर का एक अच्छा संकेतक माना जाता है. दुर्भाग्य से, के रूप में Khoubnasabjafari और दूसरों द्वारा प्रलेखित के रूप में, TBARS परख अक्सर आयोजित किया जाता है और उन तरीकों से व्याख्या की जाती है जो संदिग्ध निष्कर्षों की सुविधा प्रदान करते हैं3,4,7,8,9,10,11. इस के लिए कारणों को मुख्य रूप से नमूना से संबंधित पूर्व विश्लेषणात्मक चर और परख बीहड़ता की कमी है कि परख परिणामों में पर्याप्त परिवर्तन के बिना परख प्रोटोकॉल में प्रतीत होता है मामूली भिन्नताओं को प्रतिबंधित करता है में निहित हैं1,7,12,13.
Biospecimen हैंडलिंग और भंडारण से संबंधित preanalytical चर (उदाहरण के लिए, रक्त प्लाज्मा अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया)14,15 TBARS परख परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ सकता है16,17; इतना है कि TBARS परख परिणामों की तुलना विभिन्न प्रयोगशालाओं में नहीं की जानी चाहिए जब तक कि स्पष्ट interlaboratory विश्लेषणात्मक सत्यापन डेटा द्वारा warranted. यह सिफारिश इस बात के समान है कि पश्चिमी धब्बों का आमतौर पर उपयोग और व्याख्या कैसे की जाती है। बैंड घनत्व की तुलना भीतर-धब्बा और शायद प्रयोगशाला अध्ययनों के भीतर के लिए मान्य है, लेकिन प्रयोगशालाओं के बीच बैंड घनत्व की तुलना आम तौर पर एक अमान्य अभ्यास माना जाता है।
कुछ शोधकर्ताओं ने सुझाव दिया है कि TBARS परख द्वारा मापा गया एमडीए बस एक स्वीकार्य बायोमार्कर 3,9,10,18,19 के लिए आवश्यक विश्लेषणात्मक या नैदानिक मानदंडों को पूरा नहीं करता है। दरअसल, अगर परख 50 साल पहले विकसित नहीं किया गया था, तो यह शायद व्यापक उपयोग और मौन स्वीकार्यता है कि यह आज है प्राप्त नहीं होता. यद्यपि अधिक से अधिक विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, विशिष्टता, और ऑक्सीडेटिव तनाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बीहड़ता के साथ अन्य assays हैं, 532 एनएम पर absorbance के आधार पर TBARS परख लिपिड पेरोक्सीडेशन 20 के निर्धारण के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले assays में से एक है, और इस प्रकार ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन।
TBARS परख केवल एक महंगी किट (400 अमेरिकी डॉलर से अधिक) के रूप में पाया जा सकता है, जिसमें निर्देश उपयोग किए गए अभिकर्मकों की अधिकांश सांद्रता पर विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रदान किए गए अभिकर्मकों का उपयोग केवल एक प्रयोग के लिए किया जा सकता है, क्योंकि प्रति किट केवल एक colorimetric मानक वक्र बनाया जा सकता है। यह उन शोधकर्ताओं के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जो विभिन्न समय बिंदुओं पर कुछ नमूनों के भीतर ऑक्सीकरण के स्तर को निर्धारित करने का इरादा रखते हैं, क्योंकि एक ही मानक वक्र का उपयोग कई बार नहीं किया जा सकता है। इसलिए, कई प्रयोगों के लिए कई किट खरीदने की आवश्यकता है। वर्तमान में, जब तक एक महंगी किट खरीदा जाता है, वहाँ कैसे एक TBARS परख करने के लिए के लिए उपलब्ध एक विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं है. अतीत में कुछ शोधकर्ताओं ने अस्पष्ट रूप से वर्णन किया है कि कैसे एक TBARS assay21,22 प्रदर्शन करने के लिए, लेकिन न तो एक पूरी तरह से विस्तृत प्रोटोकॉल या व्यापक वीडियो कैसे एक महंगी किट के बिना TBARS परख का संचालन करने के लिए साहित्य में उपलब्ध है.
यहाँ हम एक विस्तृत, विश्लेषणात्मक रूप से मान्य उद्देश्य पद्धति के लिए रिपोर्ट कैसे एक सरल, पुन: प्रस्तुत करने योग्य, और सस्ती तरीके से एक TBARS परख प्रदर्शन करने के लिए पर. मानव सीरम के लिपिड पेरोक्सीडेशन में परिवर्तन, HepG2 lysates, और Cu (II) आयनों के साथ उपचार पर कम घनत्व लिपोप्रोटीन TBARS परख के लिए उदाहरण अनुप्रयोगों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. परिणामों से पता चलता है कि इस TBARS परख एक दिन के लिए दिन के आधार पर लगातार और पुन: प्रस्तुत करने योग्य है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इसकी सीमाओं के बावजूद1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 और प्रयोगशालाओं के बीच तुलना के लिए उपयुक्तता की कमी के बावजूद, TBARS परख सबसे पुराने <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या के तहत भाग में समर्थित किया गया था। R33 CA217702 और छात्र विकास (IMSD) कार्यक्रम को अधिकतम करने के लिए पहल। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करे।
Materials
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642–262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
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