骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価
Summary
このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。
Abstract
エクソソームは、ほぼすべての細胞から放出され、すべての体液中に分泌される小さな細胞外小胞です。これらの小胞を単離するために、超遠心分離、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィーなど、多くの方法が開発されています。しかし、すべてが大規模なエクソソームの精製や特性評価に適しているわけではありません。ここでは、成体マウスの骨格筋から単離された初代線維芽細胞の培養を確立し、その後、これらの細胞の培養培地からエキソソームを精製および特性評価するためのプロトコルを概説します。この方法は、連続した遠心分離ステップとそれに続くスクロース密度勾配の使用に基づいています。次に、エキソソーム調製の純度を、一連の標準マーカー(Alix、CD9、CD81など)を用いたウェスタンブロット解析によって検証します。プロトコルは機能調査のための電子顕微鏡検査、質量分析および通風管の実験のためのbioactiveexosomesを隔離し、集中する方法を記述する。スケールアップやスケールダウンが容易で、さまざまな細胞タイプ、組織、体液からのエクソソーム単離に適応させることができます。
Introduction
エクソソームは、30〜150nmのサイズの不均一な細胞外小胞です。それらは、組織や器官に遍在的に分布していることから、生理学的および病理学的プロセスにおける確立された主要なプレーヤーです1,2。エクソソームは、タンパク質、脂質、DNAタイプ、RNAタイプの複雑なカーゴを運び、それらはそれらが由来する細胞の種類によって異なります1,2,3。エクソソームは、異なる機能を持つタンパク質(すなわち、CD9およびCD63を含むテトラスパニン)が豊富であり、融合イベントの原因となります。例えば、熱ショックタンパク質であるHSP70やHSP90は、抗原の結合や提示に関与しています。さらに、アリックス、Tsg101、およびフロチリンは、エクソソームの生合成と放出に関与し、これらのナノベシクルのマーカーとして広く使用されています2,3,4。
また、エクソソームにはさまざまなRNA(マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA)が含まれており、これらはレシピエント細胞に伝達され、下流のシグナル伝達に影響を与えます3。単一の単位膜で囲まれているため、エクソソームの生理活性は、タンパク質および核酸のカーゴだけでなく、制限膜1の脂質成分にも依存する。エキソソーム膜には、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、コレステロール、スフィンゴミエリン、アラキドン酸、その他の脂肪酸が豊富に含まれており、これらはすべてエクソソームの安定性と膜トポロジーに影響を与える可能性があります2,3。カーゴと脂質の配置の結果として、エクソソームは受容細胞のシグナル伝達経路を開始し、正常組織生理学の維持に関与します1,2,4,5。特定の病理学的条件(すなわち、神経変性、線維症、および癌)の下で、それらは病理学的刺激を誘発し、伝播することが示されています4,6,7,8,9,10,11。
エクソソームは、近隣または遠隔の部位にシグナルを伝播する能力があるため、疾患の診断や予後のための貴重なバイオマーカーとなっています。さらに、エクソソームは治療用化合物のビヒクルとして実験的に使用されている2,12。これらのナノベシクルを臨床に応用する可能性は、最大の収量、純度、および再現性を達成するために、単離法をますます重要にしています。エクソソームを単離するためのさまざまな技術が開発され、実施されています。一般に、エキソソームは、示差遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、および免疫捕捉(市販のキットを使用)によって、馴化細胞培養培地または体液から単離することができる。各アプローチには、前に説明した独自の長所と短所があります1、2、13、14。
概説されたプロトコルは、1)成体マウス腓腹筋からの一次線維芽細胞の単離と培養、および2)これらの細胞によって培地に放出されたエクソソームの精製と特性評価に焦点を当てています。機能研究のための初代線維芽細胞からのエキソソームの単離のための十分に確立されたプロトコルは、現在不足しています。初代線維芽細胞は大量のエクソソームを分泌しないため、単離と精製のプロセスが困難になります。このプロトコルは形態学的な完全性および機能活動を維持している間大きい培養容積からのたくさんの純粋なexosomesの浄化を記述する。馴化培地から得られた精製エキソソームは、レシピエント細胞に特異的なシグナル伝達経路を誘導するために、in vitroでの取り込み実験で成功裏に使用されています。また、複数の生体試料から採取したエキソソームカーゴの比較プロテオミクス解析にも使用されています4。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルで概説されているように、培地からのエキソソームの単離を成功させるための重要なステップは、成体骨格筋からの初代マウス線維芽細胞培養の適切な確立と維持です。これらの培養物は、生理学的に類似した状態(骨格筋のO2レベルは~2.5 %)を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります15。初代線維芽細胞は、培養に何度も通すと特性?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo(アレッサンドラ・ダッツォ)は、Jewelers for Children(JFC)の遺伝学および遺伝子治療の寄附講座を保持しています。この活動は、NIHの助成金R01GM104981、RO1DK095169、CA021764、メンフィスのアッシジ財団、およびアメリカのレバノンのシリア関連慈善団体によって部分的に支援されました。
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Referências
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