Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques
Summary
Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.
Abstract
Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires libérées par pratiquement toutes les cellules et sécrétées dans tous les fluides biologiques. De nombreuses méthodes ont été développées pour l’isolement de ces vésicules, notamment l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille. Cependant, tous ne sont pas adaptés à la purification et à la caractérisation des exosomes à grande échelle. Voici un protocole pour l’établissement de cultures de fibroblastes primaires isolés à partir de muscles squelettiques de souris adultes, suivis de la purification et de la caractérisation des exosomes à partir des milieux de culture de ces cellules. La méthode est basée sur l’utilisation d’étapes de centrifugation séquentielles suivies de gradients de densité de saccharose. La pureté des préparations exosomiques est ensuite validée par des analyses par transfert Western à l’aide d’une batterie de marqueurs canoniques (c’est-à-dire Alix, CD9 et CD81). Le protocole décrit comment isoler et concentrer des exosomes bioactifs pour la microscopie électronique, la spectrométrie de masse et les expériences d’absorption pour les études fonctionnelles. Il peut facilement être mis à l’échelle ou réduit et adapté pour l’isolement d’exosomes à partir de différents types de cellules, de tissus et de fluides biologiques.
Introduction
Les exosomes sont des vésicules extracellulaires hétérogènes dont la taille varie de 30 à 150 nm. Ils sont des acteurs clés établis dans les processus physiologiques et pathologiques, étant donné leur distribution omniprésente dans les tissus et les organes 1,2. Les exosomes transportent une cargaison complexe de protéines, de lipides, de types d’ADN et de types d’ARN, qui varient selon le type de cellules dont ils sont dérivés 1,2,3. Les exosomes sont enrichis en protéines qui ont des fonctions différentes (c’est-à-dire que les tétraspanines, y compris CD9 et CD63) sont responsables des événements de fusion. Par exemple, les protéines de choc thermique HSP70 et HSP90 sont impliquées dans la liaison et la présentation de l’antigène. De plus, Alix, Tsg101 et la flottilline participent à la biogenèse et à la libération des exosomes et sont largement utilisés comme marqueurs de ces nanovésicules 2,3,4.
Les exosomes contiennent également une variété d’ARN (c’est-à-dire des microARN, de longs ARN non codants, des ARN ribosomiques) qui peuvent être transférés aux cellules réceptrices, où ils influencent la signalisation en aval3. Étant entourés d’une seule unité de membrane, la bioactivité des exosomes dépend non seulement de la cargaison de protéines et d’acides nucléiques, mais aussi des composants lipidiques de la membrane limitante1. Les membranes exosomiques sont enrichies en phosphatidylsérine, en acide phosphatidique, en cholestérol, en sphingomyéline, en acide arachidonique et en autres acides gras, qui peuvent tous influencer la stabilité des exosomes et la topologie membranaire 2,3. En raison de l’arrangement de la cargaison et des lipides, les exosomes initient des voies de signalisation dans les cellules réceptrices et participent au maintien d’une physiologie tissulaire normale 1,2,4,5. Dans certaines conditions pathologiques (c’est-à-dire la neurodégénérescence, la fibrose et le cancer), il a été démontré qu’ils déclenchent et propagent des stimuli pathologiques 4,6,7,8,9,10,11.
En raison de leur capacité à propager des signaux à des sites voisins ou éloignés, les exosomes sont devenus des biomarqueurs précieux pour le diagnostic ou le pronostic des maladies. De plus, les exosomes ont été utilisés expérimentalement comme véhicules de composés thérapeutiques 2,12. L’application potentielle de ces nanovésicules en clinique rend la méthode d’isolement de plus en plus importante afin d’obtenir un rendement, une pureté et une reproductibilité maximum. Différentes techniques d’isolement des exosomes ont été développées et mises en œuvre. En général, les exosomes peuvent être isolés à partir de milieux de culture cellulaire conditionnés ou de fluides corporels par centrifugation différentielle, chromatographie d’exclusion de taille et capture immunitaire (à l’aide de kits disponibles dans le commerce). Chaque approche présente des avantages et des inconvénients uniques qui ont été discutés précédemment 1,2,13,14.
Le protocole décrit se concentre sur 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir de muscles gastrocnémiens de souris adultes et 2) la purification et la caractérisation des exosomes libérés dans le milieu de culture par ces cellules. Il n’existe actuellement pas de protocole bien établi pour l’isolement des exosomes des fibroblastes primaires dans le cadre d’études fonctionnelles. Les fibroblastes primaires ne sécrètent pas de grandes quantités d’exosomes, ce qui rend le processus d’isolement et de purification difficile. Ce protocole décrit la purification de grandes quantités d’exosomes purs à partir de grands volumes de culture tout en maintenant leur intégrité morphologique et leur activité fonctionnelle. Des exosomes purifiés obtenus à partir d’un milieu conditionné ont été utilisés avec succès dans des expériences d’absorption in vitro pour induire des voies de signalisation spécifiques dans les cellules réceptrices. Ils ont également été utilisés pour des analyses protéomiques comparatives de cargaisons exosomiques provenant de plusieurs échantillons biologiques4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape cruciale pour l’isolement réussi des exosomes des milieux de culture, telle que décrite dans ce protocole, est l’établissement et le maintien appropriés de cultures primaires de fibroblastes de souris à partir du muscle squelettique adulte. Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O2 dans le muscle squelettique est de ~2,5 %)15. Les fibroblastes primaires changeront de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo est titulaire de la chaire de génétique et de thérapie génique de Jewelers for Children (JFC). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH R01GM104981, RO1DK095169 et CA021764, la Fondation Assise de Memphis et l’American Lebanese Syrian Associated Charities.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Referências
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