Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten
Summary
Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.
Abstract
Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die von praktisch allen Zellen freigesetzt und in allen biologischen Flüssigkeiten sezerniert werden. Für die Isolierung dieser Vesikel wurden viele Methoden entwickelt, darunter Ultrazentrifugation, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie. Allerdings eignen sich nicht alle für die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen in großem Maßstab. Hier wird ein Protokoll für die Etablierung von Kulturen primärer Fibroblasten beschrieben, die aus adulten Skelettmuskeln von Mäusen isoliert wurden, gefolgt von der Reinigung und Charakterisierung von Exosomen aus den Kulturmedien dieser Zellen. Die Methode basiert auf der Verwendung von sequentiellen Zentrifugationsschritten, gefolgt von Saccharosedichtegradienten. Die Reinheit der exosomalen Präparate wird dann durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung einer Reihe von kanonischen Markern (d. h. Alix, CD9 und CD81) validiert. Das Protokoll beschreibt, wie bioaktive Exosomen für Elektronenmikroskopie, Massenspektrometrie und Aufnahmeexperimente für funktionelle Studien isoliert und konzentriert werden. Es kann leicht nach oben oder unten skaliert und für die Exosomenisolierung aus verschiedenen Zelltypen, Geweben und biologischen Flüssigkeiten angepasst werden.
Introduction
Exosomen sind heterogene extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von 30 bis 150 nm. Sie sind aufgrund ihrer ubiquitären Verteilung in Geweben und Organen etablierte Schlüsselakteure in physiologischen und pathologischen Prozessen 1,2. Exosomen tragen eine komplexe Fracht von Proteinen, Lipiden, DNA-Typen und RNA-Typen, die je nach Art der Zellen, von denen sie stammen, variieren 1,2,3. Exosomen sind mit Proteinen angereichert, die unterschiedliche Funktionen haben (z. B. Tetraspanine, einschließlich CD9 und CD63), die für Fusionsereignisse verantwortlich sind. Zum Beispiel sind die Hitzeschockproteine HSP70 und HSP90 an der Antigenbindung und -präsentation beteiligt. Darüber hinaus sind Alix, Tsg101 und Flotillin an der Biogenese und Freisetzung von Exosomen beteiligt und werden häufig als Marker dieser Nanovesikel verwendet 2,3,4.
Exosomen enthalten auch eine Vielzahl von RNAs (d. h. microRNAs, lange nicht-kodierende RNAs, ribosomale RNAs), die auf Empfängerzellen übertragen werden können, wo sie die nachgeschaltete Signalübertragung beeinflussen3. Da die Bioaktivität des Exosoms von einer einzigen Membran umschlossen ist, hängt sie nicht nur von der Ladung von Proteinen und Nukleinsäuren ab, sondern auch von den Lipidkomponenten der begrenzenden Membran1. Exosomale Membranen sind mit Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Cholesterin, Sphingomyelin, Arachidonsäure und anderen Fettsäuren angereichert, die alle die Stabilität des Exosoms und die Membrantopologie beeinflussen können 2,3. Als Ergebnis der Ladungs- und Lipidanordnung initiieren Exosomen Signalwege in aufnehmenden Zellen und sind an der Aufrechterhaltung der normalen Gewebephysiologie beteiligt 1,2,4,5. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen (z. B. Neurodegeneration, Fibrose und Krebs) hat sich gezeigt, dass sie pathologische Reize auslösen und verbreiten 4,6,7,8,9,10,11.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Signale an benachbarte oder entfernte Orte weiterzugeben, sind Exosomen zu wertvollen Biomarkern für die Diagnose oder Prognose von Krankheiten geworden. Darüber hinaus wurden Exosomen experimentell als Vehikel therapeutischer Verbindungenverwendet 2,12. Durch die potenzielle Anwendung dieser Nanovesikel in der Klinik wird die Isolierungsmethode immer wichtiger, um maximale Ausbeute, Reinheit und Reproduzierbarkeit zu erreichen. Verschiedene Techniken zur Isolierung von Exosomen wurden entwickelt und implementiert. Im Allgemeinen können Exosomen aus konditionierten Zellkulturmedien oder Körperflüssigkeiten durch Differentialzentrifugation, Größenausschlusschromatographie und Immuneinfang (unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits) isoliert werden. Jeder Ansatz hat einzigartige Vor- und Nachteile, die bereits erörtert wurden 1,2,13,14.
Das skizzierte Protokoll konzentriert sich auf die 1) Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Gastrocnemius-Muskel der Maus und 2) die Reinigung und Charakterisierung von Exosomen, die von diesen Zellen in das Kulturmedium freigesetzt werden. Ein gut etabliertes Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus primären Fibroblasten für funktionelle Studien fehlt derzeit. Primäre Fibroblasten sezernieren keine großen Mengen an Exosomen, was den Isolierungs- und Reinigungsprozess zu einer Herausforderung macht. Dieses Protokoll beschreibt die Aufreinigung großer Mengen reiner Exosomen aus großen Kulturvolumina unter Beibehaltung ihrer morphologischen Integrität und funktionellen Aktivität. Gereinigte Exosomen, die aus konditioniertem Medium gewonnen wurden, wurden erfolgreich in In-vitro-Aufnahmeexperimenten eingesetzt, um spezifische Signalwege in Empfängerzellen zu induzieren. Sie wurden auch für vergleichende proteomische Analysen von exosomalen Ladungen aus mehreren biologischen Proben verwendet4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus den Nährmedien, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die ordnungsgemäße Etablierung und Aufrechterhaltung von primären Maus-Fibroblastenkulturen aus adulter Skelettmuskulatur. Diese Kulturen müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologisch ähnliche Bedingungen zu gewährleisten (O2-Spiegel in der Skelettmuskulatur beträgt ~2,5 %)15. Primäre Fibroblasten ändern ihre Eige…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alessandra d’Azzo ist Inhaberin des Stiftungslehrstuhls für Genetik und Gentherapie von Jewelers for Children (JFC). Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH-Zuschüsse R01GM104981, RO1DK095169 und CA021764, die Assisi Foundation of Memphis und die American Lebanese Syrian Associated Charities unterstützt.
Materials
| 10 cm dishes | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| 15 cm dishes | Midwest Scientific | TP93150 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Chemidoc MP imaging system | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter with plate electrodes | BioRad | 1704070 | |
| Criterion TGX stain-free protein gel | BioRad | 5678034 | 10% 18-well, midi-gel |
| Criterion vertical electrophoresis cell (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | neutral protease, grade II |
| Dithiothreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco’s Modification Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 352070 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega multi-mode microplate reader | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Transfer membranes | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Magnesium acetate solution | Sigma | 63052-100ml | |
| Non-fat dry milk | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubator | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Premium microcentrifuge tubes | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1.7 mL |
| Protected disposable scalpels | Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Running buffer | BioRad | 1610732 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Sterile cell strainer (70 mm) | Fisher Scientific, Fisher brand | 22-363-548 | |
| Sucrose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Thin wall Polypropylene tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Transfer buffer | BioRad | 16110734 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma | 91228-100G | |
| Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 solution | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | No phenol red |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrifuge Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Ultra-clear tube (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-clear tubes (25×89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Water bath Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Referências
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