الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية
Summary
يظهر هنا مقايسة مضان حساسة لمراقبة نشاط البروتين الشحمي N-acyltransferase باستخدام ببتيد ثنائي أسيل جليسريل وألكاين فوسفوليبيدات كركائز مع كيمياء النقر.
Abstract
يتم تعديل البروتينات الدهنية من البكتيريا البروتينية بعد الترجمة بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية الغشائية عن طريق عمل ثلاثة إنزيمات غشائية متكاملة ، مما ينتج عنه بروتينات ثلاثية الأسيلات. تتضمن الخطوة الأولى في مسار تعديل البروتين الدهني نقل مجموعة دياسيل جليسريل من فوسفاتيديل جليسرول إلى البروتين البروتيني ، مما ينتج عنه بروتين بروليبوبروتين ثنائي الغليسيريل. في الخطوة الثانية ، يتم شق ببتيد إشارة البروتين البروتيني ، مكونا بروتين شحمي ، والذي بدوره يتم تعديله بواسطة حمض دهني ثالث مشتق من الفوسفوليبيد. يتم تحفيز هذه الخطوة الأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt). يعد مسار تعديل البروتين الدهني ضروريا في معظم البكتيريا البروتينية γ ، مما يجعله هدفا محتملا لتطوير عوامل مضادة للبكتيريا جديدة. الموصوف هنا هو اختبار حساس ل Lnt متوافق مع الفحص عالي الإنتاجية للجزيئات المثبطة الصغيرة. الإنزيم والركائز هي جزيئات مدمجة في الغشاء. لذلك ، فإن تطوير اختبار في المختبر ليس بالأمر السهل. وهذا يشمل تنقية الإنزيم النشط في وجود المنظفات ، وتوافر الألكاين الفوسفوليبيد وركائز الببتيد ثنائي الغليسيريل ، وظروف التفاعل في المذيلات المختلطة. علاوة على ذلك ، من أجل استخدام اختبار النشاط في إعداد فحص عالي الإنتاجية (HTS) ، تفضل القراءة المباشرة لمنتج التفاعل على التفاعلات الأنزيمية المقترنة. في مقايسة الإنزيم الفلورومترية هذه ، يتم تحويل منتج الببتيد ثلاثي الكيلات إلى الفلورسنت من خلال تفاعل كيمياء النقر ويتم اكتشافه في شكل لوحة متعددة الآبار. تنطبق هذه الطريقة على أسيلترانسفيراز الأخرى التي تستخدم ركائز تحتوي على الأحماض الدهنية ، بما في ذلك الدهون الفوسفاتية وأسيل-CoA.
Introduction
تتميز البروتينات الدهنية البكتيرية بالأحماض الدهنية المرتبطة تساهميا في أمينو تيرميني والتي يتم من خلالها تثبيتها في الأغشية 1,2. الجزء الناضج من البروتين متنوع للغاية في البنية والوظيفة ، مما يفسر دور البروتينات الدهنية في العمليات البيولوجية المختلفة في غلاف الخلية البكتيرية.
يتم تعديل البروتينات الدهنية بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد بعد إدخالها في الغشاء السيتوبلازمي. تحتوي البروتينات البروليبوبروتينية على شكل مميز ، وهو lipobox ، والذي يحتوي على بقايا سيستين ثابتة تصبح أسيلية وأول حمض أميني في البروتين الناضج. يتم تحفيز الخطوة الأولى من هذا المسار بواسطة البروتين البروليبوبروتين فوسفاتيديل جليسرول: :d iacylglyceryl transferase (Lgt) ، الذي ينقل مجموعة diacylglyceryl من phosphatidylglycerol إلى البروتين البروليبوبروتين عبر رابط ثيوثير بين دياسيل جليسريل والسيستين. إشارة الببتيداز II (Lsp) تشق ببتيد الإشارة من البروتين البروليبوبروتين ثنائي الأسيل غليسيريل ، مما ينتج عنه بروتين شحمي مثبت في الغشاء من خلال مجموعة دياسيل جليسيريل. يتم تحفيز الخطوة الثالثة والأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt) ، والذي يضيف حمضا دهنيا من موضع sn-1 من الفوسفوليبيد على صميم البروتين الشحمي ، مما ينتج عنه بروتين دهني ناضج ثلاثي الأضلاع (الشكل 1) 3. تفاعل Lnt هو تفاعل بينج بونج من خطوتين حيث يتم تكوين وسيط إنزيم أسيل ثيوستر مستقر. يتحرر الناتج الثانوي لليسوفوفوسفوليبيد قبل تسيل ركيزة البروتين الشحمي في الخطوة الثانية من التفاعل.
يتم تحديد خصوصية ركيزة الفوسفوليبيد في مقايسة Lnt بناء على التحول الحركي لببتيد N-acyl diacylglyceryl على نسبة عالية من Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. كانت الفوسفوليبيدات ذات مجموعات الرأس القطبية الصغيرة ، المشبعة [sn-1] وغير المشبعة [sn-2] ، ركائز مفضلة 4. مقايسة إزاحة الهلام ليست مناسبة للدراسات الحركية المكثفة للبروتين الشحمي N-acyltransferase ولا ل HTS لتحديد الجزيئات المثبطة. تم استخدام كيمياء النقر باستخدام أحماض الألكين الدهنية بنجاح لدراسة تعديل البروتين الدهني في البكتيريا5 واستقلاب الأحماض الدهنية في حقيقيات النوى6. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن مقايسة في المختبر من رأس palmitoylation لتحديد مثبطات7.
في الطريقة الموضحة هنا ، يتم تحضين Lnt النشط المنقى في المنظفات مع ركائز في مذيلات مختلطة لتشكيل الببتيد ثلاثي الأسيل الألكاين الذي يتم اكتشافه لاحقا بواسطة مطياف التألق.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول اختبار Lnt الموصوف هنا ، بناء على الكشف عن مضان المنتج ثلاثي الأسيل ، حساس وقابل للتكرار. يعد الارتباط المحدد والفعال للبيوتين بالستربتافيدين عنصرا أساسيا في الفحص. يتم أيضا تمييز ركيزة Alkyne-POPE المتبقية بعد الانتهاء من تفاعل Lnt بالفلورسنت باستخدام FAM ولكن يتم إزالتها بكفاءة بعد الا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فابريس أغو وأليكس بوشارلات من منصة الفحص الكيميائي والبيولوجي ، مركز الموارد التكنولوجية والبحوث (C2RT) في معهد باستور باريس على الاقتراحات المفيدة حول البروتوكول ، وجميع أعضاء وحدة BGPB على الدعم والمناقشات العلمية ، وسيمون ليجود على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل العمل من قبل مبادرات الرعاية العالمية لمعهد كارنو للأمراض المعدية ومعهد كارنو للميكروبات والصحة (15 CARN 0017-01 و 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
