בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה
Summary
מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.
Abstract
ליפופרוטאינים מפרוטאובקטריה משתנים לאחר תרגום על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים של הממברנה על ידי פעולה של שלושה אנזימי ממברנה אינטגרליים, וכתוצאה מכך חלבונים טריאצילטים. השלב הראשון במסלול שינוי ליפופרוטאין כרוך בהעברת קבוצת דיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך דיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין. בשלב השני, פפטיד האות של פרוליפופרוטאין נבקע, ויוצר אפוליפופרוטאין, אשר בתורו משתנה על ידי חומצת שומן שלישית הנגזרת מפוספוליפיד. שלב אחרון זה הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt). מסלול שינוי הליפופרוטאין חיוני ברוב הפרוטאובקטריה γ, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לפיתוח חומרים אנטיבקטריאליים חדשים. המתוארת כאן היא בדיקה רגישה עבור Lnt התואמת להקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות מעכבות קטנות. האנזים והסובסטרטים הם מולקולות משובצות ממברנה; לכן, הפיתוח של בדיקת מבחנה אינו פשוט. זה כולל טיהור של האנזים הפעיל בנוכחות דטרגנט, את הזמינות של אלקין-פוספוליפידים וסובסטרטים פפטידים diacylglyceryl, ואת תנאי התגובה במיזלים מעורבים. יתר על כן, על מנת להשתמש במבחן הפעילות במערך סינון בתפוקה גבוהה (HTS), עדיפה קריאה ישירה של מוצר התגובה על פני תגובות אנזימטיות מצומדות. בבדיקת אנזים פלואורומטרית זו, תוצר הפפטיד האלקין-טריאצטילטי הופך לפלואורסצנטי באמצעות תגובת קליק-כימיה ומזוהה בפורמט של צלחת מרובת בתים. שיטה זו ישימה לאצילטרנספראזות אחרות המשתמשות במצעים המכילים חומצות שומן, כולל פוספוליפידים ואציל-CoA.
Introduction
ליפופרוטאינים חיידקיים מאופיינים בחומצות שומן הקשורות באופן קוולנטי באמינו-טרמיני שלהם, שדרכן הם מעוגנים לממברנות 1,2. החלק הבוגר של החלבון מגוון מאוד במבנה ובתפקוד, ובכך מסביר את תפקידם של ליפופרוטאינים בתהליכים ביולוגיים שונים במעטפת התא החיידקי.
ליפופרוטאינים משתנים על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים לאחר החדרתם לקרום הציטופלסמי. הפרוליפופרוטאינים מכילים מוטיב חתימה, הליפובוקס, המכיל שאריות ציסטאין אינווריאנטיות שהופכות לאצילציה וחומצת האמינו הראשונה בחלבון הבוגר. השלב הראשון של מסלול זה מזורז על ידי פרוליפופרוטאין פוספטידילגליצרול::d iacylglyceryl transferase (Lgt), אשר מעביר את קבוצת הדיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין באמצעות קישור תיואתר בין דיאצילגליצריל לציסטאין. אות פפטידאז II (Lsp) מבקע את פפטיד האות מדיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין, והתוצאה היא אפוליפופרוטאין המעוגן לתוך הממברנה דרך הדיאצילגליצריל מואטי שלו. השלב השלישי והאחרון הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt), אשר מוסיף חומצת שומן ממיקום sn-1 של פוספוליפיד על אפוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך ליפופרוטאין בוגר טריאצילציה (איור 1)3. תגובת Lnt היא תגובת פינג-פונג דו-שלבית שבה נוצר אנזים תיואסטר אציל יציב. תוצר הלוואי של הליזופוספוליפידים משתחרר לפני האצילציה של מצע האפוליפופרוטאין בשלב השני של התגובה.
הספציפיות של המצע הפוספוליפידי נקבעת בבדיקת Lnt בהתבסס על תזוזת הניידות של N-אציל דיאצילגליצריל פפטיד על אחוז גבוה של Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. פוספוליפידים עם קבוצות ראש קוטביות קטנות, רוויים [sn-1] ולא רוויים [sn-2], היו מצעים מועדפים4. בדיקת הסטת הג’ל אינה מתאימה למחקרים קינטיים נרחבים של אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז וגם לא ל-HTS לזיהוי מולקולות מעכבות. כימיה של קליקים באמצעות חומצות שומן אלקין שימשה בהצלחה לחקר שינוי ליפופרוטאין בחיידקים5 ומטבוליזם של חומצות שומן באאוקריוטים6. לאחרונה דווח על בדיקה חוץ-גופית של Ras palmitoylation לזיהוי מעכבים7.
בשיטה המתוארת כאן, Lnt פעיל מטוהר בדטרגנט הוא דגירה עם מצעים ב micelles מעורבים כדי ליצור פפטיד alkyne-triacylated כי הוא זוהה לאחר מכן על ידי ספקטרומטריה פלואורסצנטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול של בדיקת Lnt המתואר כאן, המבוסס על זיהוי פלואורסצנטי של המוצר הטריאצילי, הוא רגיש וניתן לשחזור. ההיקשרות הספציפית והיעילה של ביוטין לסטרפטווידין היא מרכיב מרכזי בבדיקה. מצע Alkyne-POPE שנותר לאחר השלמת תגובת Lnt מסומן גם הוא באופן פלואורסצנטי עם FAM אך מוסר ביעילות לאחר קשירת לוחות הסטרפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפבריס אגו ואליקס בוצ’רלט מפלטפורמת הסינון הכימוגנומית והביולוגית, המרכז למשאבים טכנולוגיים ומחקר (C2RT) במכון פסטר פריז על הצעות מועילות לפרוטוקול, לכל חברי יחידת BGPB לתמיכה ודיונים מדעיים, ולסיימון לגוד על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה מומנה על ידי יוזמות טיפול גלובליות של המכון קרנו מחלות זיהומיות והמכון קרנו מיקרובים ובריאות (15 CARN 0017-01 ו 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
