Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Summary

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l’attività dell’apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Abstract

Le lipoproteine dei proteobatteri sono modificate post-traduzionalmente dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi di membrana mediante l’azione di tre enzimi integrali di membrana, con conseguente proteine triacilate. Il primo passo nella via di modificazione della lipoproteina comporta il trasferimento di un gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina, con conseguente diacilgliceril prolipoproteina. Nella seconda fase, il peptide segnale della prolipoproteina viene scisso, formando un’apolipoproteina, che a sua volta viene modificata da un terzo acido grasso derivato da un fosfolipide. Quest’ultimo passaggio è catalizzato dall’apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt). La via di modificazione delle lipoproteine è essenziale nella maggior parte dei γ-proteobatteri, rendendola un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi agenti antibatterici. Qui è descritto un test sensibile per Lnt che è compatibile con lo screening ad alto rendimento di piccole molecole inibitorie. L’enzima e i substrati sono molecole incorporate nella membrana; Pertanto, lo sviluppo di un test in vitro non è semplice. Ciò include la purificazione dell’enzima attivo in presenza di detergente, la disponibilità di alchino-fosfolipidi e substrati del peptide diacilglicerile e le condizioni di reazione nelle micelle miste. Inoltre, al fine di utilizzare il test di attività in una configurazione di screening ad alta produttività (HTS), la lettura diretta del prodotto di reazione è preferibile rispetto alle reazioni enzimatiche accoppiate. In questo saggio enzimatico fluorometrico, il prodotto peptidico alchino-triacilato viene reso fluorescente attraverso una reazione click-chimica e rilevato in un formato multipozzetto. Questo metodo è applicabile ad altre aciltransferasi che utilizzano substrati contenenti acidi grassi, inclusi fosfolipidi e acil-CoA.

Introduction

Le lipoproteine batteriche sono caratterizzate da acidi grassi legati covalentemente ai loro amino-termini attraverso i quali sono ancorati nelle membrane ^1,2. La parte matura della proteina è molto diversificata nella struttura e nella funzione, spiegando così il ruolo delle lipoproteine in vari processi biologici nell’involucro cellulare batterico.

Le lipoproteine sono modificate dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi dopo l’inserimento nella membrana citoplasmatica. Le prolipoproteine contengono un motivo distintivo, il lipobox, che contiene un residuo di cisteina invariante che diventa acilato e il primo amminoacido nella proteina matura. Il primo passo di questa via è catalizzato dalla prolipoproteina fosfatidilglicerolo::d iacylglyceryl transferasi (Lgt), che trasferisce il gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina attraverso un legame tioetere tra diacilgliceril e cisteina. La peptidasi segnale II (Lsp) fende il peptide segnale dalla diacilgliceril prolipoproteina, risultando in un’apolipoproteina che è ancorata nella membrana attraverso la sua porzione di diacilglicerile. La terza e ultima fase è catalizzata dall’apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt), che aggiunge un acido grasso dalla posizione sn-1 del fosfolipide all’apolipoproteina, risultando in lipoproteina matura triacilata (Figura 1)³. La reazione Lnt è una reazione ping-pong in due fasi in cui si forma un intermedio enzima acilico tioestere stabile. Il sottoprodotto lisofosfolipide viene rilasciato prima dell’acilazione del substrato dell’apolipoproteina nella seconda fase della reazione.

La specificità del substrato fosfolipidico è determinata in un saggio Lnt basato sullo spostamento della mobilità del peptide N-acildiacilglicerile su un’alta percentuale di Tris-Tricine Urea SDS-PAGE⁴. I fosfolipidi con piccoli gruppi polari, saturi [sn-1] e non saturi [sn-2], erano substrati preferiti ⁴. Il test di spostamento del gel non è appropriato per studi cinetici approfonditi sull’apolipoproteina N-aciltransferasi né per HTS per identificare molecole inibitorie. La click-chemistry che utilizza acidi grassi alchini è stata utilizzata con successo per studiare la modificazione delle lipoproteine nei batteri⁵ e il metabolismo degli acidi grassi negli eucarioti⁶. Recentemente, è stato riportato un test in vitro di palmitoilazione di Ras per identificare gli inibitori⁷.

Nel metodo qui descritto, Lnt attivo purificato nel detergente viene incubato con substrati in micelle miste per formare peptide alchino-triacilato che viene successivamente rilevato mediante spettrometria di fluorescenza.

Protocol

1. Preparazione di enzimi e substrati Purificazione dell’enzima Produrre e purificare l’enzima Lnt dalle membrane solubilizzate detergenti come descritto in precedenza 4,8. In breve, indurre l’espressione del gene lnt-streptococco, che codifica per Lnt con un tag C-terminale Streptococco, a OD 600 di 0,6 con tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C per 16 ore. Raccogliere le cellule mediante centr…

Representative Results

Nella reazione Lnt l’acido grasso sn-1 dai fosfolipidi viene trasferito su un peptide diacilglicerile, risultando inpeptide triacilato 8 maturo. Il test Lnt in vitro qui descritto è progettato per utilizzare fosfolipidi contenenti un acido grasso alchino (alchino-POPE) e FSL-1-biotina come substrati, con conseguente formazione di alchino-FSL-1-biotina. Dopo una reazione chimica a scatto con azido-FAM, questo prodotto dovrebbe essere marcato con fluorescenza e rilevato mediante spettromet…

Discussion

Il protocollo per il saggio Lnt qui descritto, basato sulla rilevazione a fluorescenza del prodotto triacilato, è sensibile e riproducibile. Il legame specifico ed efficiente della biotina alla streptavidina è un elemento chiave nel test. Anche il substrato alchino-POPE rimasto dopo il completamento della reazione Lnt è marcato in modo fluorescente con FAM, ma viene rimosso in modo efficiente dopo il legame sulle piastre di streptavidina mediante più fasi di lavaggio. Inoltre, l’aggiunta di DMSO non influisce sull’at…

Materials

Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation