Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer
Summary
Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.
Abstract
Lipoproteïnen uit proteobacteriën worden posttranslationeel gemodificeerd door vetzuren afgeleid van membraanfosfolipiden door de werking van drie integrale membraanenzymen, wat resulteert in getriacyleerde eiwitten. De eerste stap in de lipoproteïnemodificatieroute omvat de overdracht van een diacylglycerylgroep van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne, wat resulteert in diacylglycerylprolipoproteïne. In de tweede stap wordt het signaalpeptide van prolipoproteïne gesplitst en vormt het een apolipoproteïne, dat op zijn beurt wordt gewijzigd door een derde vetzuur afgeleid van een fosfolipide. Deze laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt). De lipoproteïnemodificatieroute is essentieel in de meeste γ-proteobacteriën, waardoor het een potentieel doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen. Hier wordt een gevoelige test voor Lnt beschreven die compatibel is met high-throughput screening van kleine remmende moleculen. Het enzym en de substraten zijn membraan-ingebedde moleculen; daarom is de ontwikkeling van een in vitro test niet eenvoudig. Dit omvat de zuivering van het actieve enzym in aanwezigheid van wasmiddel, de beschikbaarheid van alkynfosfolipiden en diacylglycerylpeptidesubstraten en de reactieomstandigheden in gemengde micellen. Om de activiteitstest te gebruiken in een high-throughput screening (HTS) opstelling, heeft directe uitlezing van het reactieproduct bovendien de voorkeur boven gekoppelde enzymatische reacties. In deze fluorometrische enzymtest wordt het alkyn-getriagyleerde peptideproduct fluorescerend gemaakt door een klikchemiereactie en gedetecteerd in een multiwell-plaatformaat. Deze methode is van toepassing op andere acyltransferasen die vetzuurhoudende substraten gebruiken, waaronder fosfolipiden en acyl-CoA.
Introduction
Bacteriële lipoproteïnen worden gekenmerkt door covalent gebonden vetzuren op hun amino-termini waardoor ze worden verankerd in membranen 1,2. Het volwassen deel van het eiwit is zeer divers in structuur en functie, waardoor de rol van lipoproteïnen in verschillende biologische processen in de bacteriële celenvelop wordt verklaard.
Lipoproteïnen worden gemodificeerd door fosfolipide-afgeleide vetzuren na inbrenging in het cytoplasmamembraan. De prolipoproteïnen bevatten een kenmerkend motief, de lipobox, die een invariant cysteïneresidu bevat dat wordt geacyleerd en het eerste aminozuur in het rijpe eiwit. De eerste stap van deze route wordt gekatalyseerd door prolipoproteïnefosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferase (Lgt), dat de diacylglycerylgroep overbrengt van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne via een thioetherverbinding tussen diacylglyceryl en cysteïne. Signaal peptidase II (Lsp) splitst het signaalpeptide van diacylglyceryl prolipoproteïne, wat resulteert in een apolipoproteïne dat via zijn diacylglycerylgroep in het membraan is verankerd. De derde en laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt), dat een vetzuur uit de sn-1-positie van fosfolipide toevoegt aan apolipoproteïne, wat resulteert in getriacyleerd rijp lipoproteïne (figuur 1)3. De Lnt-reactie is een pingpongreactie in twee stappen waarbij een stabiel thioester-acyl-enzymtussenproduct wordt gevormd. Het bijproduct van lysofosfolipide wordt vrijgegeven voorafgaand aan de acylering van het apolipoproteïnesubstraat in de tweede stap van de reactie.
De specificiteit van het fosfolipidensubstraat wordt bepaald in een Lnt-test op basis van de mobiliteitsverschuiving van N-acyldiacylglycerylpeptide op een hoog percentage Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipiden met kleine polaire kopgroepen, verzadigd [sn-1] en niet-verzadigd [sn-2], hadden de voorkeur als substraten4. De gelverschuivingstest is niet geschikt voor uitgebreide kinetische studies van apolipoproteïne N-acyltransferase, noch voor HTS om remmende moleculen te identificeren. Klikchemie met behulp van alkynvetzuren is met succes gebruikt om lipoproteïnemodificatie in bacteriën5 en vetzuurmetabolisme in eukaryoten6 te bestuderen. Onlangs werd een in vitro test van Ras-palmitoylering gemeld om remmers te identificeren7.
In de hier beschreven methode wordt gezuiverde actieve Lnt in wasmiddel geïncubeerd met substraten in gemengde micellen om alkyn-getristacyleerd peptide te vormen dat vervolgens wordt gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol voor de Lnt-test, gebaseerd op fluorescentiedetectie van het getriagyleerde product, is gevoelig en reproduceerbaar. De specifieke en efficiënte binding van biotine aan streptavidin is een belangrijk element in de test. Het alkyne-POPE-substraat dat overblijft na voltooiing van de Lnt-reactie wordt ook fluorescerend gelabeld met FAM, maar wordt efficiënt verwijderd na binding aan de streptavidinplaten door meerdere wasstappen. Bovendien heeft toevoeging van DMSO geen invloed op de Lnt-activ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Fabrice Agou en Alix Boucharlat van het Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) van Institut Pasteur Paris voor nuttige suggesties over het protocol, alle leden van de BGPB-eenheid voor ondersteuning en wetenschappelijke discussies, en Simon Legood voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd gefinancierd door Global Care Initiatives van het Institute Carnot Infectious diseases en het Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 en 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
