İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti
Summary
Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.
Abstract
Primer silya, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında, özellikle hücre döngüsünün G0/G1 evreleri sırasında, mitoz dan önce rezorbe edilir. Primer silia iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da primer silia otomatik algılama için yazılım kullanarak dahil olmak üzere son derece sofistike yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak bu yöntemlerin gerçeklefltirilmesi için primer silyanın immünüdüoresan boyamasi gerekmektedir. Bu yayın asetilli alfa tubulin boyama tarafından primer silia in vitro kolay tespiti için bir protokol açıklar (aksoneme) ve gama tubulin (bazal vücut). Bu immünofloresan boyama protokolü nispeten basittir ve yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanır. Bu protokol, primer silya’yı ifade eden dört hücre hattının (C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) nasıl sabit, immünosülvetli ve floresan veya konfokal mikroskopla görüntülenmiş olduğunu açıklamaktadır.
Introduction
Primer silia duyusal, soliter, membrana bağlı, hücrenin ana centriole ile ilişkili nonmotile yapılardır. Primer silya kırmızı kan hücreleri hariç en omurgalı hücrelerde bulunur, adipositler1, ve hepatositler2. Primer silya, ana bileşeni α-tubulin olan mikrotübüllerden oluşan uzamış bir aksonme olarak oluşur. Aksonme γ-tubulin yapılandırılır bazal gövde, yetişir. Primer silyanın uzunluğu 2-10 μm arasında değişir; ancak, boyutları glisilasyon sırasında değişebilir, açlık, hipoksi, sitotoksik stres, ya da iyonlaştırıcıradyasyonamaruz kaldıktan sonra 3,4,5,6,7. Genellikle, hücrelerin sadece bir birincil cilium var, hangi morfogenez ve hücre sinyalyolları hücre çoğalması ve farklılaşma için önemli yer almaktadır8,9.
Primer silia, özellikle G0/G1 evrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında dinamik olarak düzenlenir ve HDAC6 (histone deacetylaz 6)10aracılı tubulin deasetilasyonu ile ilişkili bir süreçte mitoz bölünmeye girmeden önce rezorbe edilir. Primer silia rezorpsiyon tam an hücre tipi ve doğrudan aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13gibi bu süreçte yer genlerin ekspresyonuna bağlıdır.13 Hücre tipine bağlı olarak, primer silya reseptörleri farklı ifade, iyon kanalları, ve aktif sinyal yolları. Bunlar arasında proliferasyon ve sağkalımı etkileyen en önemli sinyal reseptörleri, EGFR, PDGFR ve FGFR bulunmaktadır. Kirpi, Çentik ve Wnt gibi bir veya daha fazla organın işlevini etkileyebilecek sinyal yollarından bazıları da dahildir. Bu fonksiyon birincil silya Çentik için belirli ligands tespit sağlar, hormonlar, ve serotonin veya somatostatin gibi biyolojik olarak aktif maddeler. Farklı uzunluklarda primer silya tarafından sergilenen diğer özel fonksiyonlar sıcaklık, yerçekimi ve osmolality14değişikliklere reaksiyon içerir.
Birincil silia canlı görselleştirme, iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da birincil silia55,15,,16,17otomatik algılama için yazılım gibi çeşitli yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak, bu yöntemler son derece uzmanlaşmış ve devam eden araştırma araştırma her aşamasında birincil silya boyama için temel, hızlı ve kolay yöntemler ihtiyacı vardır. Açıklanan kültürlü hücrelerde birincil silya tespiti için kolay ve yararlı bir yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli yazarlar birincil silya tespiti için çeşitli yöntemler açıklanan, bazen de kendi algılama etkileyebilir çeşitli fiksasyon yöntemleri açıklayan6,20,21,22. Ne olursa olsun, algılama için tam ve basit bir protokol bulmak zordur. Böyle bir yöntemin hazır kullanılabilirliği şüphesiz birincil silya soruşturma çalışmasına büyük yardımcı olacaktır, özellikle ar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir – Uzun vadeli organizasyon geliştirme planı Askeri Sağlık Bilimleri Fakültesi, Savunma Üniversitesi Kitle İmha Silah Tıbbi Yönleri; Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti (Özel Araştırma Projesi No: SV/ FVZ201703) ve PROGRES Q40/06. Ayrıca Daniel Diaz İngilizce dil revizyon yaptığı tür yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Referências
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
