免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出
Summary
一次繊毛は、中心に関連する細胞外構造である。免疫蛍光染色による一次繊毛検出は、非常に高品質な画像をもたらす比較的簡単な手順です。このプロトコルでは、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。
Abstract
一次繊毛は、細胞周期進行中、特に細胞周期のG0/G1段階の間に動的に調節され、有糸分裂の前に再調節される。一次繊毛は、透過型電子顕微鏡、3Dイメージング、または一次繊毛の自動検出のためのソフトウェアを使用するなど、高度に洗練された方法で視覚化することができます。しかしながら、これらの方法を行うためには、一次繊毛の免疫蛍光染色が必要である。本書では、アセチル化アルファチューブリン(axoneme)とガンマ管(基底体)を染色することにより、インビトロで一次繊毛を容易に検出するためのプロトコルについて説明する。この免疫蛍光染色プロトコルは比較的単純であり、高品質の画像をもたらします。本プロトコルは、原性繊毛を発現する4つの細胞株(C2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を、どのように固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した方法を記述する。
Introduction
原性繊毛は、細胞の母中心に関連する感覚的、孤独な、膜結合性、非モタイル構造である。原発性繊毛は、赤血球、血液胞子1、および肝細胞2を除くほとんどの脊椎動物細胞に見られる。原繊毛は、細管によって構成される細長い軸索として形成され、その主成分はαチューブリンである。アキソンムは、γチューブリンから構成される基底体から成長する。プライマリ繊毛の長さは2~10μmの間で変化する。しかし、その寸法は、グリチル化、飢餓、低酸素、細胞毒性ストレス、または電離放射線33、4、5、6、74,5,6,7への暴露後に変化する可能性があります。通常、細胞は一次シリウムを1つしか持っていないが、これは形態形成および細胞シグナル伝達経路に関与し、細胞増殖および分化に重要な8,99である。
一次繊毛は、細胞周期進行中、特にG0/G1相中に動的に調節され、HDAC6(ヒストンデアセチルラーゼ6)10によって媒介される管内脱アセチル化に関連する過程で有糸分裂に入る前10にリソードされる。一次繊毛吸収の正確な瞬間は,、オーロラA、Plk1、TcTex-1 11、12、1311,など、このプロセスに直接関与する細胞の種類と遺伝子の発現に依存する。1213細胞の種類に応じて、プライマリ繊毛は異なるタイプの受容体、イオンチャネル、および活性シグナル伝達経路を発現する。これらには、増殖および生存に影響を及ぼす最も重要なシグナル伝達受容体、EGFR、PDGFR、およびFGFRが含まれる。また、ヘッジホッグ、ノッチ、Wntを含む1つ以上の器官の機能に影響を与える可能性のあるシグナル伝達経路のいくつかも含まれています。この機能により、原発性繊毛は、ノッチ、ホルモン、セロトニンまたはソマトスタチンなどの生物学的に活性な物質に対する特異的なリガンドを検出することができます。異なる長さの一次繊毛によって示される他の特定の機能は、温度、重力、および浸透病性14の変化に対する反応を含む。
一次繊毛は、ライブビジュアライゼーション、透過電子顕微鏡、3Dイメージング、または一,次繊毛5、15、16、1715の5自動検出のためのソフトウェアなど、さまざまな方法を通じて可視化することができる。,1617しかし、これらの方法は高度に専門化されており、研究のあらゆる段階で原型繊毛を染色するための基本的で迅速で簡単な方法が必要です。記載は、培養細胞における一次繊毛の検出に対する簡易で有用な方法である。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかの,著者は、プライマリ繊毛の検出のための多様な方法を説明し、時には検出6、20、21、2220,に影響を与えることができる様々な固定方法も記述している。62122いずれにせよ、検出のための完全でわかりやすいプロトコルを見つけることは困難です。このような方法の準備ができたのは、特…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、チェコ共和国の防衛省によって支援されました – 長期組織開発計画軍事保健科学部の大量破壊兵器の医療側面、防衛大学;チェコ共和国教育・青年スポーツ省(特定研究プロジェクト第一:SV/FVZ201703)とPROGRES Q40/06また、英語の改訂で彼の親切な支援のためのダニエル・ディアスに感謝します。
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
Referências
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