Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.
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Artigo de método
Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1 do ciclo celular, sendo resorcridas antes da mitose. Cilia primária pode ser visualizada com métodos altamente sofisticados, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D, ou usando software para a detecção automática de cílios primários. No entanto, a coloração imunofluorescente da cília primária é necessária para realizar esses métodos. Esta publicação descreve um protocolo para a fácil detecção de cílios primários in vitro, detectando tubulina alfa acetilada (axoneme) e gamma tubulin (corpo basal). Este protocolo de coloração imunofluorescente é relativamente simples e resulta em imagens de alta qualidade. O presente protocolo descreve como quatro linhas celulares (C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) expressando cílios primários foram fixas, imunos detidas e imagens com um microscópio fluorescente ou confocal.
Introdução
Os cílios primários são estruturas sensoriais, solitárias, ligadas à membrana, não-mastile associadas à centriola mãe da célula. Cilias primárias são encontradas na maioria das células vertebrados, com exceção de glóbulos vermelhos, adipócitos1e hepatócitos2. Cilia primária são formadas como um axoneme alongado composto por microtúbulos, cujo componente principal é α-tubulina. O axoneme cresce a partir do corpo basal, que é estruturado a partir de γ-tubulin. O comprimento da cília primária varia entre 2-10 μm; no entanto, suas dimensões podem mudar durante a glicação, fome, hipóxia, estresse citotóxico, ou após a exposiç....
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Protocolo
1. Preparação de meios culturais, soluções e pratos
- Autoclave as tampas (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de poço. Descongele o soro bovino fetal (FBS) e a penicilina/estreptomicina antibiótico e aqueça a cultura temperatura média a ambiente (TR). Use trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (salina tamponada com cálcio e magnésio) para passagem das células.
- Prepare fresco 4% paraformaldeído (PFA) em dH2O (800 mgs de PFA em 20 mL de dH2O). O PFA deve estar preparado para cada experimento. Mexa e aqueça a solução a 55 °C por 30 min no capô. Esfrie na RT. Adicione 1 M de hidróxido de sódio até que a solução fique clara (pH = 7,2-7,4). Guarde ....
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Resultados
A coloração imunofluorescente da cília primária é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de alta qualidade. Nesses experimentos, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal seguindo o protocolo descrito acima. O cílio primário foi detectado usando acetilado α-tubulin e γ-tubulin. A avaliação da cília primária pode ser realizada em vários níveis e qualquer mudança nesse sentido pode estar ligada à exposição à ra.......
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Discussão
Vários autores descreveram diversos métodos para detecção de cílios primários, às vezes também descrevendo vários métodos de fixação que podem afetar sua detecção6,,20,,21,22. Independentemente disso, é difícil encontrar um protocolo completo e simples para detecção. A disponibilidade pronta de tal método seria, sem dúvida, de grande assistência ao estudo da investigação cilia primária, especia.......
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Divulgações
Os autores não têm nada arevelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Defesa da República Tcheca - Plano de desenvolvimento de organizações de longo prazo Aspectos Médicos de Armas de Destruição Em Massa da Faculdade de Ciências da Saúde Militar da Universidade de Defesa; o Ministério da Educação, Juventude e Esporte, República Tcheca (Projeto de Pesquisa Específica Nº: SV/ FVZ201703) e PROGRES Q40/06. Obrigado também a Daniel Diaz por sua gentil assistência na revisão da língua inglesa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 6 poços | TPP | 92406 | Dimensões 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragmento de Cabra Anti-Coelho IgG |
| Anti-Tubulina &gama; | Sigma-Aldrich | T5192 | Coelho Policlonal anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (molécula inteira) F (ab ′)2 fragmentos– Anticorpo Cy3 produzido em ovelhas |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco&agudo; s Águia Modificada&agudo; s meio | Thermo Scientific | 11960044 | Alta glicose, Sem glutamina, Gibco |
| Dulbecco' s Fosfato tampolado solução salina | Sigma-Aldrich | D8662 | com MgCl2 e CaCl2, filtrado estéril, adequado para cultura de células |
| Soro bovino fetal | Thermo Scientific | 16000044 | filtrado estéril, Gibco |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Fibroblasto embrionário de camundongo |
| Tubulina antiacetilada monoclonal | Sigma-Aldrich | T7451 | Anticorpo monoclonal anti-acetilado da tubulina produzido em camundongo |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Fibroblastos pulmonares primários (humanos) |
| Soro de cabra normal | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Pó |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P0781 | 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL em 0,9% de NaCl, ProLong Diamond |
| Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Fibroblastos de pele | gentilmente presenteado pela Charles University, Faculdade de Medicina em Hradec Krá amoré. | ||
| de Lama Quadrada | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Vidro borossilicato, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Filtrado Estéril, Gibco |
Referências
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
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Reimpressões e permissões
