Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Summary

Presentato è un protocollo per l’isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (<50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Abstract

L’isolamento dei miociti cardiaci ventricolari dai cuori animali e umani è un metodo fondamentale nella ricerca cardiaca. I cardiomiociti animali sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica con enzimi digestivi. Tuttavia, isolare i cardiomiociti umani è difficile perché gli esemplari miocardici umani di solito non consentono la perfusione coronarica e protocolli di isolamento alternativi producono scarse rese di cellule vitali. Inoltre, gli esemplari miocardiali umani sono rari e regolarmente disponibili presso le istituzioni con cardiochirurgia in loco. Ciò ostacola la traduzione dei risultati dai cardiomiociti animali a quello umano. Descritto qui è un protocollo affidabile che consente l’isolamento efficiente dei miociti ventricolari dal miocardio umano e animale. Per aumentare il rapporto superficie-volume riducendo al minimo i danni alle cellule, le fette di tessuto miocardiale di 300 m di spessore vengono generate da campioni miocardici con un vibrato. Le fette di tessuto vengono poi digerito con proteasi e collagenasi. Il miocardio del ratto è stato utilizzato per stabilire il protocollo e quantificare le rese dei miociti vitali e tolleranti al calcio mediante il conteggio delle cellule citometriche di flusso. Il confronto con il metodo di parti di tessuto comunemente usato ha mostrato rese significativamente più elevate di cardiomiociti a forma di asta (41,5 x 11,9 contro 7,89 x 3,6%, p < 0,05). Il protocollo è stato tradotto in miocardio umano in mancanza e non in mancanza, dove le rese erano simili a quelle del miocardio di ratto e, ancora una volta, nettamente più elevate rispetto al metodo del pezzo di tessuto (45,0 x 15,0 contro 6,87 : 5,23 cellule/mg, p < 0,05). In particolare, con il protocollo presentato è possibile isolare un numero ragionevole di cardiomiociti umani vitali (9-200 cellule/mg) da quantità minime di tessuto (<50 mg). Così, il metodo è applicabile al miocardio sano e in mancanza da cuori umani e animali. Inoltre, è possibile isolare i miociti eccitabili e contrattili da campioni di tessuto umano conservati fino a 36 h in soluzione cardioplegica fredda, rendendo il metodo particolarmente utile per i laboratori presso le istituzioni senza cardiochirurgia in loco.

Introduction

Una tecnica seminale che ha spianato la strada a importanti approfondimenti sulla fisiologia cardiomiocite è l’isolamento dei cardiomiociti ventricolari viventi dai cuori intatti¹. I cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per studiare la normale struttura cellulare e la funzione, o le conseguenze degli esperimenti in vivo; ad esempio, per valutare i cambiamenti nell’elettrofisiologia cellulare o nell’accoppiamento eccitazione-contrazione nei modelli animali di malattia cardiaca. Inoltre, cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per la coltura cellulare, interventi farmacologici, trasferimento genico, ingegneria tissunte, e molte altre applicazioni. Pertanto, metodi efficienti per l’isolamento cardiomiocato sono di fondamentale importanza per la ricerca cardiaca di base e traslazionale.

I cardiomiociti di piccoli mammiferi, come i roditori, e da mammiferi più grandi, come maiali o cani, sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica del cuore con soluzioni contenenti collagene grezze e/o proteasi. Questo è stato descritto come il metodo “gold standard” per l’isolamento cardiomiocato, con conseguente resa fino al 70% delle cellule vitali². L’approccio è stato utilizzato anche con i cuori umani, con conseguente cardiomiocazione accettabile produce^3,4,5. Tuttavia, poiché la perfusione coronarica è fattibile solo se il cuore intatto o un grande cuneo miocardiale contenente un ramo dell’arteria coronaria è disponibile, la maggior parte degli esemplari cardiaci umani non sono adatti a questo approccio a causa delle loro piccole dimensioni e della mancanza di una vascolatura appropriata. Pertanto, l’isolamento dei cardiomiociti umani è impegnativo.

I campioni miocardali umani sono per lo più costituiti da blocchi di tessuto di dimensioni variabili (circa 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), ottenuti attraverso biopsie endomiocardali⁶, miectomie setttiva⁷, impianti VAD⁸, o da cuori espiantati⁹. Le procedure più comuni per l’isolamento cardiomiocato iniziano con l’amatare il tessuto utilizzando forbici o un bisturi. I contatti tra cellule vengono poi interrotti dall’immersione nei tamponi senza calcio o a basso contenuto di calcio. Questo è seguito da più passaggi di digestione con estratti di enzimi grezzi o enzimi purificati come proteasi (ad esempio, trypsina), collagenasi, ialuronidae, o elastase, con conseguente disintegrazione della matrice extracellulare e liberazione dei cardiomiociti. In una fase finale, critica, una concentrazione fisiologica di calcio deve essere accuratamente ripristinata, o il danno cellulare può verificarsi a causa del calcio-paradosso^10,11,12. Questo approccio di isolamento è conveniente, ma in genere inefficiente. Per esempio, uno studio ha scoperto che quasi 1 g di tessuto miocardiale era necessario per ottenere un numero sufficiente di cardiomiociti adatti per esperimenti successivi¹³. Una possibile ragione per basse rese è il metodo relativamente duro di macinare il tessuto. Questo può danneggiare in particolare i cardiomiociti situati ai bordi del pezzo anche se questi miociti sono più probabilità di essere rilasciato dalla digestione ezimatica.

Un altro aspetto che può influenzare l’efficienza di isolamento e la qualità delle cellule ottenute da campioni umani è la durata dell’ischemia del tessuto. La maggior parte dei protocolli menzionano i tempi di trasporto brevi al laboratorio come prerequisito per buoni risultati. Questo limita lo studio dei cardiomiociti ventricolari umani ai laboratori con strutture di cardiochirurgia nelle vicinanze. Insieme, queste restrizioni ostacolano la verifica di importanti risultati da modelli animali nei cardiomiociti umani. Sono quindi auspicabili protocolli di isolamento migliorati che consentono rese elevate di cardiomiocazione da piccole quantità di tessuto, preferibilmente senza gravi danni dopo lunghi tempi di trasporto.

Descritto qui è un protocollo di isolamento basato sulla digestione ezimatica di sottili fette di tessuto miocardiale generate con un vibratome^14,15. Dimostriamo che l’isolamento dalle fette di tessuto è molto più efficiente di quello dei pezzi di tessuto macinati con le forbici. Il metodo descritto non solo consente elevate rese di cardiomiociti umani vitali da piccole quantità di tessuto miocardico, ma è applicabile anche ai campioni immagazzinati o trasportati in soluzione cardioplegica fredda per un massimo di 36 h.

Protocol

Tutti gli esperimenti con i ratti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali Mittelfranken, Baviera, Germania. La raccolta e l’uso di campioni di tessuto cardiaco umano è stato approvato dagli Institutional Review Boards dell’Università di Erlangen-Nornberg e della Ruhr-University Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti. I ra…

Representative Results

Per verificare l’efficienza dell’isolamento, il protocollo è stato utilizzato con il miocardio di ratto e il numero risultante di miociti vitali è stato confrontato con i numeri ottenuti dall’isolamento tramite perfusione coronarica e dall’isolamento da piccoli blocchi di tessuto (isolamento dei blocchi, Figura 2). L’isolamento dei blocchi e l’isolamento dalle fette di tessuto sono stati eseguiti dagli stessi cuori. Per l’isolamento tramite perfusione coronarica, tuttavia, è stato utilizz…

Discussion

Anche se l’isolamento dei cardiomiociti viventi è stato stabilito più di 40 anni fa ed è ancora un prerequisito per molti approcci sperimentali nella ricerca cardiaca, rimane una tecnica difficile con esiti imprevedibili. L’isolamento dei cardiomiocite tramite perfusione delle arterie coronarie con soluzione enzimatica è comunemente usato per i cuori di piccoli animali e produce un gran numero di cellule vitali. Tuttavia, ciò richiede un sistema e una competenza relativamente complessi. Inoltre, la maggior parte dei…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection