ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離
Summary
提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(<50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。
Abstract
動物およびヒトの心臓から心室心筋細胞を分離することは、心臓研究の基本的な方法である。動物の心筋細胞は、一般的に消化酵素と冠状動脈灌流によって単離される。しかし、ヒト心筋細胞の単離は、ヒト心筋標本が冠状灌流を許容しないのが通常であり、代替分離プロトコルは生存細胞の収率が悪いため、困難である。さらに、ヒト心筋標本はまれであり、オンサイト心臓手術を受けた機関でのみ定期的に入手可能である。これは、動物からヒト心筋細胞への所見の翻訳を妨げる。ここで説明する信頼性の高いプロトコルは、心室筋細胞をヒトおよび動物心筋膜から効率的に分離することを可能にする。細胞の損傷を最小限に抑えながら表面対体積比を高めるために、300μm厚の心筋組織スライスは、ビブラートメを用いた心筋標本から生成される。その後、組織スライスをプロテアーゼとコラゲアーゼで消化します。ラット心筋は、フロー細胞測定細胞計数によって、プロトコルを確立し、生存可能なカルシウム耐性筋細胞の収量を定量化するために使用された。一般的に使用される組織チャンク法との比較は、棒状心筋細胞の有意に高い収率を示した(41.5±11.9対7.89±3.6%、p<0.05)。このプロトコルは、ラット心筋と同様に収率が著しく高い失敗したヒト心筋(45.0 ±15.0対6.87±5.23細胞/mg、p<0.05)に翻訳された。特に、提示されたプロトコルでは、生存可能なヒト心筋細胞(9〜200細胞/mg)の合理的な数を最小限の組織(<50mg)から分離することが可能である。したがって、この方法は、人間と動物の両方の心臓からの健康で失敗した心筋に適用可能である。さらに、冷たい心肢麻痺溶液中で最大36時間保存されたヒト組織標本から興奮性および収縮性筋細胞を分離することができ、オンサイト心臓手術を受けずに機関の実験室に特に有用な方法を作り出す。
Introduction
心筋細胞生理学に関する重要な洞察への道を開いた精膜技術は、無傷の心臓から生きている心室心筋細胞の分離である1.分離された心筋細胞は、正常な細胞構造と機能、または生体内実験の結果を研究するために使用することができます。例えば、心疾患の動物モデルにおける細胞電生理学または興奮収縮結合の変化を評価する。さらに、分離された心筋細胞は、細胞培養、薬理学的介入、遺伝子導入、組織工学、および他の多くの用途に使用することができる。したがって、心筋細胞の分離のための効率的な方法は、基礎的および翻訳的な心臓研究にとって基本的な価値がある。
げっ歯類などの小さな哺乳類や、豚やイヌなどの大型哺乳類の心筋細胞は、一般的に、粗なコラゲアーゼおよび/またはプロテアーゼを含む溶液で心臓の冠状灌流によって単離される。これは心筋細胞単離のための「ゴールドスタンダード」法として説明されており、その結果、生存細胞の70%までの収率が2となる。このアプローチは人間の心臓でも使用されており、その結果、許容可能な心筋細胞の収量は,3、4、5,5である。しかし冠状動脈灌流は、無傷の心臓や冠状動脈枝を含む大きな心筋のくさびが利用できる場合にのみ実現可能であるため、ほとんどのヒト心臓検体は、その小さなサイズと適切な血管構造の欠如のために、このアプローチには適していません。したがって、ヒト心筋細胞の単離は困難です。
ヒト心筋標本は主に可変サイズの組織塊(約0.5 x 0.5 x 0.5 cm〜2 x 2 x 2 x 2 cm)から成り、心外筋生検6、中隔筋切除術7、VAD移植8、または外植体9から得られる。心筋細胞の分離のための最も一般的な手順は、はさみまたはメスを使用して組織をミンチから始める。細胞間接触は、カルシウムフリーまたは低カルシウムバッファーに浸漬することによって破壊される。その後、粗酵素抽出物またはプロテアーゼ(トリプシン)、コラゲラーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼなどの酵素を含む複数の消化ステップが続き、細胞外マトリックスの崩壊および心筋細胞の解放が生じる。最終的な重要なステップでは、生理的カルシウム濃度を注意深く回復しなければならないか、カルシウムパラドックス10、11、1211,12による細胞損傷が起こり得る。10この分離アプローチは便利ですが、通常は非効率的です。例えば、ある研究では、13の実験に適した十分な数の心筋細胞を得るために、ほぼ1gの心筋組織が必要であることがわかった。低収量の考えられる理由は、組織をミンチする比較的過酷な方法です。これは、これらの筋細胞が酵素消化によって放出される可能性が最も高いが、チャンクエッジに位置する心筋細胞に特に損傷を与える可能性がある。
ヒト検体から得られる細胞の分離効率と質に影響を与える可能性のあるもう一つの側面は、組織虚血の持続時間である。ほとんどのプロトコルは、良い結果のための前提条件として実験室への短い輸送時間を言及しています。これは、近くの心臓手術施設を持つ実験室にヒト心室心筋細胞の研究を制限します。これらの制限は、ヒト心筋細胞の動物モデルからの重要な知見の検証を妨げる。したがって、少量の組織からの高い心筋細胞収量を可能にする改善された分離プロトコルは、輸送時間の延長後に重大な損傷を受けることなく、望ましい。
ここで説明する分離プロトコルは、ビブラート膜14,15,15で生成された薄い心筋組織スライスの酵素消化に基づく。我々は、組織スライスからの分離は、はさみで刻まれた組織塊からのよりはるかに効率的であることを実証する。この方法は、少量の心筋組織から生じるヒト心筋細胞の高収量を可能にするだけでなく、最大36時間の冷たい心肢麻痺溶液中に保存または輸送された標本にも適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
生きている心筋細胞の分離は40年以上前に確立され、心臓研究における多くの実験的アプローチの前提条件であるが、予測不可能な結果を伴う困難な技術のままである。酵素溶液を用いた冠状動脈の灌流による心筋細胞の単離は、一般的に小動物の心臓に使用され、多数の生存細胞を生み出す。しかし、これには比較的複雑なシステムと専門知識が必要です。さらに、ほとんどのヒト組織サ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LMUミュンヘンのウォルター・ブレンデル実験医学センターのアンドレアス・デンドルファーに、スライスプロトコルの助けに感謝したいと思います。ヒト心筋組織サンプルを提供するために、心臓外科科、アーランゲン大学病院、ヘンドリック・ミルティング、エーリッヒ・アンド・ハンナ・クレシュマン研究所、ルール大学ボーフム、ムハンナド・アルカッサーのヒト心筋組織サンプルに感謝したいと思います。フローサイトメトリーのサポートのために、私たちはサイモン・フェルクルとトランスレーショナル・リサーチ・センター(TRC)、大学病院アーランゲンの同僚に感謝したいと思います。また、セルラー分子生理学研究所のローレンツ・マクカーゴとセリーヌ・グリュニンガーに感謝します。
この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)、エアランゲン・ニュルンベルク大学病院の学際学領域研究センター(IZKF)、アーランゲン・ヌルンベルク大学、エルランゲン・ニュルンベルク大学によって支援されました。
Materials
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
Referências
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