Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

Summary

Представлен протокол для изоляции человека и животных желудочков кардиомиоцитов от вибрато-вырезать миокарда ломтиками. Высокие урожаи клеток, терпимых к кальцию (до 200 клеток/мг), можно получить из небольшого количества тканей (lt;50 мг). Протокол применим к миокарду, подвергаемому воздействию холодной ишемии на срок до 36 ч.

Abstract

Изоляция желудочковых сердечных миоцитов от сердца животных и человека является фундаментальным методом в кардиологических исследованиях. Кардиомиоциты животных обычно изолируются коронарной перфузией с пищеварительными ферментами. Тем не менее, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей, потому что человеческие образцы миокарда, как правило, не позволяют коронарной перфузии, и альтернативные протоколы изоляции привести к низкой урожайности жизнеспособных клеток. Кроме того, образцы миокарда человека встречаются редко и доступны только в учреждениях с кардиохирургией на месте. Это препятствует переводу находок с животных на кардиомиоциты человека. Описано здесь надежный протокол, который позволяет эффективно изоляции желудочковых миоцитов от человека и животных миокарда. Для увеличения соотношения поверхности к объему при минимизации повреждения клеток, ломтики миокардной ткани толщиной 300 мкм генерируются из образцов миокарда с вибромом. Ткань ломтиками затем переваривается с протеазы и коллагеназы. Крысиный миокард использовался для установления протокола и количественной оценки урожайности жизнеспособных, терпимых к кальцию миоцитоцитов путем подсчета потоко-цитометрических клеток. Сравнение с широко используемым методом тканей-куска показало значительно более высокие урожаи родообразных кардиомиоцитов (41,5 и 11,9 против 7,89 и 3,6%, р 0,05). Протокол был переведен на неудачный и несовершеный миокард человека, где урожайность была такой же, как в крысином миокарде, и, опять же, заметно выше, чем при методе тканевой кусок (45,0 и 15,0 против 6,87 и 5,23 клетки/мг, p lt; 0,05). Примечательно, что с представленным протоколом можно изолировать разумное количество жизнеспособных кардиомиоцитов человека (9–200 клеток/мг) от минимального количества тканей (lt;50 мг). Таким образом, метод применим к здоровому и отсутствию миокарда как из сердца человека, так и из сердца животных. Кроме того, можно изолировать возбудимые и контрактильные миоциты из образцов тканей человека, хранящихся до 36 ч в холодном кардиоплегическом растворе, что делает метод особенно полезным для лабораторий в учреждениях без кардиохирургии.

Introduction

Семенной метод, который проложил путь к важной идеи в кардиомиоцитов физиологии является изоляция живых желудочков кардиомиоцитов из нетронутых^{сердец 1}. Изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для изучения нормальной клеточной структуры и функции, или последствия экспериментов in vivo; например, для оценки изменений в клеточной электрофизиологии или возбуждении-сокращении связи в животных моделях сердечных заболеваний. Кроме того, изолированные кардиомиоциты могут быть использованы для клеточной культуры, фармакологических вмешательств, передачи генов, тканевой инженерии и многих других применений. Поэтому эффективные методы изоляции кардиомиоцитов имеют основополагающее значение для фундаментальных и трансляционных сердечных исследований.

Кардиомиоциты мелких млекопитающих, таких как грызуны, и от крупных млекопитающих, таких как свиньи или собаки, обычно изолированы коронарной перфузией сердца с растворами, содержащими сырые коллагеназы и/или протеазы. Это было описано как “золотой стандарт” метод для кардиомиоцитов изоляции, в результате чего дает до 70% жизнеспособных клеток². Подход также был использован с человеческим сердцем, в результате чего приемлемые кардиомиоциты^{дает 3,,4,,5}. Однако, поскольку коронарная перфузия возможна только в том случае, если имеется нетронутое сердце или большой клин миокарда, содержащий ветку коронарной артерии, большинство образцов сердца человека не подходят для такого подхода из-за их небольшого размера и отсутствия соответствующей сосудов. Таким образом, изоляция человеческих кардиомиоцитов является сложной задачей.

Образцы миокарда человека в основном состоят из кусков тканей переменного размера (примерно 0,5 х 0,5 х 0,5 см до 2 х 2 х 2 см), полученных через эндомиокарда^{биопсии 6},^{перегородки миэктомии 7}, ВАЗ^{имплантации 8}, или от explanted^{сердца 9}. Наиболее распространенные процедуры для изоляции кардиомиоцитов начинаются с заминки ткани с помощью ножниц или скальпеля. Контакты от клетки к клетке затем нарушаются погружением в буферы без кальция или с низким содержанием кальция. За этим следуют несколько шагов пищеварения с сырыми экстрактами ферментов или очищенных ферментов, таких как протеазы (например, трипсин), коллагеназа, гиалуронидаза или эластаза, что приводит к распаду внеклеточной матрицы и освобождению кардиомиоцитов. В заключительном, критическом шаге, физиологическая концентрация кальция должна быть тщательно восстановлена, или повреждение клеток может произойти из-за^{кальция-парадокса 10,,11,,12}. Такой подход к изоляции удобен, но обычно неэффективен. Например, одно исследование показало, что почти 1 г ткани миокарда требуется для получения достаточного количества кардиомиоцитов, пригодных для последующих^{экспериментов 13}. Возможной причиной низкой урожайности является относительно жесткий метод дования тканей. Это может особенно повредить кардиомиоциты, расположенные на краю куска, хотя эти миоциты, скорее всего, будут освобождены от энзиматического пищеварения.

Другим аспектом, который может повлиять на эффективность изоляции и качество клеток, полученных из человеческих образцов, является продолжительность ишемии тканей. В большинстве протоколов в качестве предпосылки для хороших результатов упоминается короткое время транспортировки в лабораторию. Это ограничивает изучение желудочковых кардиомиоцитов человека в лабораториях с близлежащими средствами кардиохирургии. В совокупности эти ограничения препятствуют проверке важных выводов, полученных от моделей животных в кардиомиоцитах человека. Поэтому желательно улучшить протоколы изоляции, которые позволяют высокой урожайности кардиомиоцитов из небольшого количества тканей, предпочтительно без серьезных повреждений после длительного времени транспортировки.

Описано здесь протокол изоляции, основанный на энзиматическом пищеварении тонких ломтиков миокарда ткани, генерируемых вибромой^14,15. Мы демонстрируем, что изоляция от ломтиков тканей является гораздо более эффективным, чем от тканей куски фарш с ножницами. Описанный метод не только позволяет высокую урожайность жизнеспособных человеческих кардиомиоцитов из небольшого количества миокардной ткани, но и применим к образцам, хранящимся или транспортируемым в холодном кардиоплегическом растворе до 36 ч.

Protocol

Все эксперименты с крысами были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Mittelfranken, Бавария, Германия. Сбор и использование образцов сердечной ткани человека было одобрено Институциональными советами по обзору Университета Эрлангена-Нюрнберга и Рур-Университета Бохума….

Representative Results

Для проверки эффективности изоляции протокол использовался с крысиным миокардом, и полученное в результате этого число жизнеспособных миоцитов сравнивали с числами, полученными в результате изоляции через коронарную перфузию и изоляции от небольших кусков ткани (изоляция куска, <strong…

Discussion

Хотя изоляция живых кардиомиоцитов была создана более 40 лет назад и до сих пор является необходимым условием для многих экспериментальных подходов в кардиологических исследованиях, она остается сложной техникой с непредсказуемыми исходами. Кардиомиоцитная изоляция через перфузию к?…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection