Beschreven is de celkweek en blootstellingsmethode van een in vitro bronchiaal model voor realistische, herhaalde inhalatieblootstelling aan deeltjes voor toxiciteitstests.
Voor toxiciteitstests van deeltjes in de lucht zijn blootstellingssystemen voor lucht-vloeistofinterface (ALI) ontwikkeld voor in vitro tests om realistische blootstellingsomstandigheden na te bootsen. Dit stelt specifieke eisen aan de celcultuurmodellen. Veel celtypen worden negatief beïnvloed door blootstelling aan lucht (bijv. uitdroging) en blijven slechts enkele dagen levensvatbaar. Dit beperkt de blootstellingsomstandigheden die in deze modellen kunnen worden gebruikt: meestal worden relatief hoge concentraties toegepast als een wolk (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten, die zich snel vestigen) binnen een korte periode. Dergelijke experimentele omstandigheden weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes. Om deze beperkingen te overwinnen, werd het gebruik van een menselijke bronchiale epitheelcellijn onderzocht. Deze cellen kunnen enkele weken onder ALI-omstandigheden worden gekweekt met behoud van een gezonde morfologie en een stabiele monolaag met nauwe verbindingen. Bovendien is dit bronchiale model geschikt voor het testen van de effecten van herhaalde blootstelling aan lage, realistische concentraties deeltjes in de lucht met behulp van een ALI-blootstellingssysteem. Dit systeem maakt gebruik van een continue luchtstroom in tegenstelling tot andere ALI-blootstellingssystemen die één verneveling gebruiken die een wolk produceert. Daarom is het continue stroomsysteem geschikt voor herhaalde en langdurige blootstelling aan deeltjes in de lucht, terwijl de deeltjeskenmerken, de blootstellingsconcentratie en de geleverde dosis voortdurend worden gecontroleerd. Samen is dit bronchiale model, in combinatie met het continue stroomblootstellingssysteem, in staat om realistische, herhaalde inhalatieblootstellingsomstandigheden na te bootsen die kunnen worden gebruikt voor toxiciteitstests.
De longen zijn kwetsbaar voor inademingsblootstelling aan deeltjes in de lucht. Om de potentiële toxiciteit van deeltjes in de lucht te beoordelen, is vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van blootstellingssystemen voor lucht-vloeistofinterface (ALI)1,2,3,4,5. ALI-blootstellingssystemen maken relevantere en realistischere blootstellingsmodellen mogelijk in vergelijking met traditionele blootstelling onder water via een kweekmedium dat de kenmerken en kinetiek van de deeltjes verandert6. De ALI-blootstellingssystemen stellen specifieke eisen aan de celcultuurmodellen, omdat de modellen cultuurmedium en dus voedingsstoffen aan de apicale kant missen. Veel celmodellen worden negatief beïnvloed door gekweekt en blootgesteld te worden aan de lucht (bijv. uitdroging) en blijven slechts enkele dagen levensvatbaar. Dit beperkt de blootstellingsomstandigheden die in deze modellen kunnen worden gebruikt: meestal worden relatief hoge concentraties binnen korte tijd als een wolk toegepast (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten, die zich snel vestigen). Dergelijke experimentele omstandigheden weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes; de relevantie van de resultaten kan dus in twijfel worden getrokken. Om deze beperkingen te overwinnen, werd het kweek- en blootstellingsprotocol voor een bronchiaal model bestaande uit de menselijke bronchiale epitheelcellijn Calu-37 geoptimaliseerd.
De meeste in vitro longmodellen die worden gebruikt voor blootstelling aan ALI bevatten andere cellijnen zoals A549, BEAS-2B en 16HBE14o- (16HBE) of primaire cellen als basis8. Deze cellijnen hebben als nadeel dat ze slechts een paar dagen levensvatbaar blijven wanneer ze bij de ALI worden gekweekt. Bovendien overgroeien sommige van deze cellijnen wanneer ze langer dan 5 dagen worden gekweekt. Ten slotte missen A549-cellen functionele nauwe verbindingen en kunnen daarom geen strakke barrière vormen die nodig is om de longen na te bootsen9,10. Primaire epitheelcellen kunnen een goede optie zijn voor BLOOTSTELLING aan ALI, omdat ze wekenlang bij de ALI kunnen worden gekweekt. Primaire cellen verschillen echter van batch tot batch, zijn moeilijker te onderhouden en zijn duurder in vergelijking met cellijnen, waardoor ze minder geschikt zijn voor toxiciteitstests en screening. Bij het vergelijken van verschillende menselijke bronchiale epitheelcellijnen (16HBE, Calu-3, H292 en BEAS-2B), voldoen alleen de Calu-3-cellen aan alle criteria die nodig zijn voor realistische, herhaalde ALI-blootstelling: ze blijven weken levensvatbaar terwijl ze bij de ALI worden gekweekt, bieden een hoge barrière-integriteit, overgroeien niet en zijn gemakkelijk te cultureren en te onderhouden. Calu-3 cellen zijn afkomstig van een adenocarcinoom en kunnen slijm produceren11,12. Er zijn inconsistenties over de vraag of de cellen trilharen11,13kunnen ontwikkelen . Calu-3-cellen zijn ook een geschikt model om respiratoire syncytiele virusinfecties (RSV) te bestuderen die ciliated airway epitheelcellen infecteren14.
Naast het celmodel wordt een geautomatiseerd blootstellingssysteem (AES) gebruikt voor de lucht-vloeistofblootstelling aan aerosolen15,16. De AES heeft het voordeel dat het een continue luchtstroom gebruikt om het celmodel bloot te stellen aan aerosolen. Dit in tegenstelling tot andere lucht-vloeistofblootstellingssystemen die gewoonlijk binnen korte tijd relatief hoge concentraties gebruiken als wolk (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten die zich snel vestigen)17,18,19. Deze cloudsystemen weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes. Door een continue luchtstroom toe te passen met behulp van de AES, kan het celmodel gedurende een langere periode worden blootgesteld aan een lage concentratie deeltjes, wat realistische blootstellingsomstandigheden weerspiegelt. Een ander voordeel ten opzichte van cloudsystemen is dat de AES de mogelijkheid heeft om deeltjeskarakteriseringsinstrumenten aan te sluiten, waardoor deeltjesgrootte, getalconcentratie en massa in de loop van de tijd kunnen worden gemeten. Een beperking van de AES is dat het relatief hoge luchtstromen gebruikt tussen 10 ml/min en 100 ml/min.
Dit artikel beschrijft een methode om menselijke bronchiale epitheelcellen onder ALI te cultiveren en dit bronchiale model bloot te stellen aan aerosolen of gassen. Het voordeel van het gebruik van Calu-3 cellen is dat ze nauwe verbindingen vormen, een monolaag blijven, de luchtstroom kunnen weerstaan en wekenlang kunnen worden gekweekt bij de ALI, in tegenstelling tot veel andere celtypen (bijv. 16HBE, H292 en BEAS-2B). Het gebruik van de VITROCELL® automated exposure station (AES) heeft als voordeel dat de cellen onder realistische en relevante omstandigheden kunnen worden blootgesteld, omdat lage concentraties kunnen worden toegepast met behulp van een continue luchtstroom.
Continue stroomsystemen, zoals de AES, hebben voordelen ten opzichte van het gebruik van cloudsystemen3,32, die één verneveling van een ophanging gebruiken. De continue stroom is realistischer en veel variabelen zoals debiet, vochtigheid en temperatuur worden geregeld. Bovendien kan de afzetting worden verbeterd met behulp van een elektrisch veld. Ten slotte worden aerosolkenmerken zoals grootte, getalconcentratie en massa online gecontroleerd. Een nadeel is dat continue flow systemen complexer zijn in vergelijking met cloudsystemen. Daarom is het belangrijk om voorbereidende experimenten uit te voeren die zich richten op de deeltjeskenmerken van de aerosol en de geleverde dosis op de insert. De initiële startconcentratie van de deeltjes en de AES-instellingen kunnen vervolgens worden aangepast om de gewenste dosis op de cellen te bereiken33. Afhankelijk van het type deeltjes dat wordt getest, kan de aerosolgeneratiemethode verschillen. Het gebruik van elektrostatische afzetting hangt af van het deeltjestype en werkt het beste voor metaaldeeltjes. Voor deeltjes met een positieve oppervlaktelading moet een negatief elektrostatisch veld worden aangebracht en vice versa.
Selectie van blootstellingsconcentraties kan moeilijk zijn voor elk experiment tussen lucht en vloeistof. Voor de DQ12-blootstellingen was het doel om na 3 weken blootstelling, 5 dagen per week, 4 uur per dag een totale cumulatieve dosis van 1 μg/cm2 te bereiken. Deze dosis is vergelijkbaar met doses die een effect veroorzaakten in vivo21,25,27,32,33. Bij het uitvoeren van de blootstellingen was er enige variatie tussen verschillende blootstellingsdagen. Hoewel de werkelijk afgezette dosis van 1,6 μg/cm2 hoger is dan de 1 μg/cm2 waarvoor was gestreefd, was de dosis mogelijk te laag om effecten in het Calu-3-model waar te nemen. Er werden slechts kleine verschillen in TEER, levensvatbaarheid en cytokinerespons waargenomen tussen de blootstelling aan schone lucht en de blootstelling aan DQ12, en deze verschillen waren niet statistisch significant. Een verklaring voor de constatering dat blootstelling aan DQ12 gedurende 3 weken geen significante effecten in de Calu-3-cellen heeft veroorzaakt, is dat macrofagen ontbraken in het Calu-3-model. Mogelijk produceren macrofagen na de opname van DQ12 pro-inflammatoire cytokinen die Calu-3-cellen kunnen beïnvloeden. Een andere verklaring is dat de DQ12-batch die voor de experimenten werd gebruikt, niet zo reactief was als verwacht. Bij gebruik van LPS als positieve controlestof vertoont Calu-3 wel een respons, gemeten aan de hand van een toename van de LDH-afgifte en een toename van de TNF-α afgifte. Dit geeft aan dat het model toxiciteit kan detecteren.
Het Calu-3 celmodel heeft veel voordelen, zoals besproken in de resultatensectie. Bovendien, wanneer gekweekt voor een langere tijd bij de ALI, de Calu-3 cellen kunnen groeien trilharen / cilia-achtige structuren13 en produceren slijm11,12,13. Ondanks deze voordelen heeft het model beperkingen met betrekking tot de fysiologische relevantie ervan. De Calu-3 cellijnen zijn afkomstig van een adenocarcinoom, terwijl 16HBE en BEAS-2B afkomstig zijn van gezond weefsel. Helaas zijn de laatste twee niet geschikt voor herhaalde ALI-blootstelling, omdat ze na verloop van tijd geen stabiele monolaag blijven. Een andere beperking van het Calu-3-model is dat het slechts één celtype vertegenwoordigt. In de menselijke long zijn meerdere celtypen aanwezig die op elkaar inwerken en anders reageren op blootstelling. Ingeademde deeltjes zullen zich in verschillende gebieden van de longen afzetten, afhankelijk van hun aerodynamische grootte. Dit is waar de deeltjes in contact komen met de epitheelcelbarrière, zoals nagebootst door het Calu-3-model. In de menselijke long worden alveolaire macrofagen aangetrokken tot de deeltjes, overspoelen ze en verwijderen ze uit de longen. Macrofagen spelen ook een essentiële rol in de ontstekingsrespons op blootstelling aan deeltjes. Daarom worden inspanningen geleverd om het Calu-3-model uit te breiden door primaire macrofagen toe te voegen om de longbarrière beter na te bootsen. Het nadeel van de macrofagen is dat ze slechts ongeveer 7 dagen levensvatbaar blijven wanneer ze bovenop Calu-3-cellen bij de ALI worden gekweekt. Daarom moeten macrofagen wekelijks worden gelezen om het huidige Calu-3-model om te zetten in een cocultuurmodel. De optimalisatie van het cocultuurprotocol is momenteel aan de gang.
Gezien het bovenstaande is het Calu-3 bronchiale model een geschikt model voor herhaalde blootstelling aan aerosolen van gedeeltelijk oplosbare stoffen zoals chemicaliën uit sigarettenrook en LPS. Deze oplosbare stoffen veroorzaken significante toenames van cytokinereacties in de Calu-3 cellen. Voor het testen van onoplosbare deeltjes zoals dieseluitlaat en DQ12 is een cocultuurmodel nodig, omdat de macrofagen een cruciale rol spelen bij de inductie van effecten door blootstelling aan deeltjes.
Voor de beschreven blootstellingen werden wisselplaten met 3,0 μm poriën gebruikt. De belangrijkste reden om voor dit type insert te kiezen, is dat het mogelijk is om de translocatie van nanomaterialen te testen. Bij gebruik van kleinere poriëngrootte van 0,4 μm kunnen deeltjesagglomeraten het wisselplaatmembraan niet passeren. Het nadeel van het gebruik van een grote poriegrootte is dat de cellen een langere tijd nodig hebben om samenvloeiend te groeien en dat het moeilijker is om de morfologie van de cellen te visualiseren met behulp van lichte microscopie. Om te controleren of de cellen een samenvloeiende monolaag vormen, moet de TEER >1.000 Ω x cm2 zijn voordat een blootstelling wordt gestart.
Samen genomen is het hier gepresenteerde Calu-3 bronchiale model geschikt voor herhaalde blootstelling aan aerosolen, ten minste tot 3 weken. Het model is bestand tegen gekweekt en blootgesteld worden via een continue luchtstroom en is in staat om toxiciteit voor het bronchiale epitheel te detecteren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt gefinancierd door EU-project PATROLS (Fysiologisch Verankerde Tools voor Realistische nanomateriaalrisico’s) en het Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport (project V/050012). We willen dr. Yvonne Staal en dr. Jan van Benthem bedanken voor het kritisch beoordelen van het manuscript.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |