Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.
Para testes de toxicidade de partículas transmitidas pelo ar, sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI) foram desenvolvidos para testes in vitro, a fim de imitar condições de exposição realistas. Isso coloca demandas específicas nos modelos de cultura celular. Muitos tipos de células são afetados negativamente pela exposição ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se instalam rapidamente) dentro de um curto período de tempo. Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Para superar essas limitações o uso de uma linha celular epitelial brônquica humana, calu-3 foi investigado. Essas células podem ser cultivadas em condições de ALI por várias semanas, mantendo uma morfologia saudável e uma monocamada estável com junções apertadas. Além disso, este modelo brônquico é adequado para testar os efeitos de exposições repetidas a baixas concentrações realistas de partículas transmitidas pelo ar usando um sistema de exposição ALI. Este sistema usa um fluxo de ar contínuo em contraste com outros sistemas de exposição ali que usam uma única nebulização produzindo uma nuvem. Portanto, o sistema de fluxo contínuo é adequado para exposição repetida e prolongada a partículas transmitidas pelo ar, monitorando continuamente as características das partículas, concentração de exposição e dose fornecida. Em conjunto, este modelo brônquico, em combinação com o sistema de exposição contínua de fluxo, é capaz de imitar condições realistas e repetidas de exposição à inalação que podem ser usadas para testes de toxicidade.
Os pulmões são vulneráveis à exposição à inalação de partículas transmitidas pelo ar. Para avaliar a toxicidade potencial das partículas transportadas pelo ar, foram feitos progressos no desenvolvimento de sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI)1,2,3,4,5. Os sistemas de exposição ALI permitem modelos de exposição mais relevantes e realistas em comparação com a exposição submersa tradicional via meio cultural que altera as características e cinéticas das partículas6. Os sistemas de exposição ali colocam demandas específicas sobre os modelos de cultura celular, pois os modelos carecem de meio de cultura e, portanto, nutrientes no lado apical. Muitos modelos celulares são afetados negativamente por serem cultivados e expostos ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se estabelecem rapidamente). Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas; assim, a relevância dos resultados pode ser questionada. Para superar essas limitações, o protocolo de cultura e exposição para um modelo brônquico composto pela linha de células epiteliais brônquicais humanas Calu-37 foi otimizado.
A maioria dos modelos pulmonares in vitro usados para exposição ali contêm outras linhas celulares como A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) ou células primárias como base8. Essas linhas celulares têm a desvantagem de que permanecem viáveis por apenas alguns dias quando cultivadas no ALI. Além disso, algumas dessas linhas de celular superessuem quando cultivadas por um período superior a 5 dias. Finalmente, as células A549 perdem junções funcionais e, portanto, não podem formar uma barreira apertada que é necessária para imitar os pulmões9,10. Células epiteliais primárias podem ser uma boa opção para a exposição ali, pois podem ser cultivadas no ALI por semanas. No entanto, as células primárias diferem de lote para lote, são mais difíceis de manter, e são mais caras em comparação com linhas celulares, o que as torna menos adequadas para testes de toxicidade e triagem. Ao comparar diferentes linhas de células epiteliais brônquias humanas (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), apenas as células Calu-3 cumprem todos os critérios necessários para exposição realista e repetida da ALI: permanecem viáveis por semanas enquanto cultivadas no ALI, fornecem uma alta barreira de integridade, não superarem demais e são fáceis de cultivar e manter. As células calu-3 são originárias de um adenocarcinoma e são capazes de produzir muco11,12. Há inconsistências quanto à possibilidade de as células desenvolverem cilia11,13. As células calu-3 também são um modelo adequado para estudar infecções pelo vírus sincicial respiratório (RSV) que infectam células epiteliais das vias aéreas ciliadas14.
Além do modelo celular, um sistema de exposição automatizado (AES) é usado para a exposição ar-líquido a aerossóis15,16. O AES tem a vantagem de usar um fluxo de ar contínuo para expor o modelo celular a aerossóis. Isso contrasta com outros sistemas de exposição ar-líquido que geralmente usam concentrações relativamente altas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas que se instalam rapidamente)17,18,19. Esses sistemas de nuvem não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Aplicando um fluxo de ar contínuo usando o AES, o modelo celular pode ser exposto a uma baixa concentração de partículas durante um período de tempo mais longo, refletindo condições realistas de exposição. Outra vantagem sobre os sistemas de nuvem é que o AES tem a opção de conectar instrumentos de caracterização de partículas, permitindo a medição do tamanho das partículas, concentração de números e massa ao longo do tempo. Uma limitação do AES é que ele usa fluxos de ar relativamente altos entre 10 mL/min e 100 mL/min.
Este artigo descreve um método para a cultura de células epiteliais brônquias humanas sob ALI e expor este modelo brônquico a aerossóis ou gases. A vantagem de usar células Calu-3 é que elas formam junções apertadas, permanecem uma monocamada, são capazes de suportar o fluxo de ar, e podem ser cultivadas por semanas no ALI, ao contrário de muitos outros tipos de células (por exemplo, 16HBE, H292 e BEAS-2B). O uso da estaçãode exposição automatizada ® VITROCELL (AES) tem a vantagem de que as células podem ser expostas em condições realistas e relevantes, pois baixas concentrações podem ser aplicadas usando um fluxo de ar contínuo.
Sistemas de fluxo contínuo, como o AES, têm vantagens em relação ao uso de sistemas de nuvem3,32, que utilizam uma única nebulização de uma suspensão. O fluxo contínuo é mais realista e muitas variáveis como vazão, umidade e temperatura são controladas. Além disso, a deposição pode ser aprimorada usando um campo elétrico. Finalmente, características do aerossol como tamanho, concentração de números e massa são monitoradas on-line. Uma desvantagem é que os sistemas de fluxo contínuo são mais complexos em comparação com os sistemas de nuvem. Por isso, é importante realizar experimentos preparatórios que se concentrem nas características de partículas do aerossol e na dose entregue na inserção. A concentração inicial das partículas e das configurações do AES pode então ser ajustada para alcançar a dose desejada nas células33. Dependendo do tipo de partículas que estão sendo testadas, o método de geração de aerossol pode diferir. O uso de deposição eletrostática depende do tipo de partícula e funciona melhor para partículas metálicas. Para partículas com uma superfície positiva carga um campo eletrostático negativo deve ser aplicado e vice-versa.
A seleção de concentrações de exposição pode ser difícil para qualquer experimento de exposição ar-líquido. Para as exposições do DQ12, o objetivo foi alcançar uma dose acumulada total de 1 μg/cm2 após 3 semanas de exposição, 5 dias por semana, 4h por dia. Esta dose é semelhante às doses que induziram um efeito in vivo21,25,27,32,33. Ao realizar as exposições, houve alguma variação entre diferentes dias de exposição. Embora a dose real depositada de 1,6 μg/cm2 seja maior do que a 1 μg/cm2 que foi destinada, a dose pode ter sido muito baixa para observar efeitos no modelo Calu-3. Apenas pequenas diferenças no TEER, viabilidade e resposta à citocina foram observadas entre a exposição ao ar limpo e a exposição ao DQ12, e essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Uma explicação para a observação de que a exposição ao DQ12 durante 3 semanas não induziu efeitos significativos nas células calu-3 é que os macrófagos estavam faltando do modelo Calu-3. Possivelmente, após a absorção do DQ12, macrófagos produzem citocinas proinflamatórias que podem afetar as células de Calu-3. Outra explicação é que o lote DQ12 que foi utilizado para os experimentos não foi tão reativo quanto o esperado. Ao usar o LPS como uma substância de controle positiva, o Calu-3 mostra uma resposta, medida por um aumento na liberação de LDH e um aumento na liberação de α TNF. Isso indica que o modelo pode detectar toxicidade.
O modelo de células Calu-3 tem muitas vantagens, como discutido na seção de resultados. Além disso, quando cultivadas por mais tempo no ALI, as células Calu-3 podem cultivar estruturas semelhantes a cílios13 e produzir muco11,12,13. Apesar dessas vantagens, o modelo tem limitações em relação à sua relevância fisiológica. As linhas celulares Calu-3 são originárias de um adenocarcinoma, enquanto 16HBE e BEAS-2B são originárias de tecido saudável. Infelizmente, os dois últimos não são adequados para a exposição repetida da ALI, pois não permanecem uma monoposta estável ao longo do tempo. Outra limitação do modelo Calu-3 é que ele representa apenas um único tipo de célula. No pulmão humano, vários tipos de células que interagem e respondem de forma diferente à exposição estão presentes. Partículas inaladas serão depositadas em diferentes regiões dos pulmões, dependendo do tamanho aerodinâmico. É aqui que as partículas entram em contato com a barreira celular epitelial, como imitado pelo modelo Calu-3. No pulmão humano, macrófagos alveolares são atraídos pelas partículas, engolfam-nas e as limpam dos pulmões. Os macrófagos também desempenham um papel essencial na resposta à inflamação à exposição de partículas. Portanto, esforços estão sendo feitos para estender o modelo Calu-3 adicionando macrófagos primários para imitar a barreira pulmonar mais de perto. A desvantagem dos macrófagos é que eles permanecem viáveis apenas por cerca de 7 dias quando cultivados em cima de células Calu-3 no ALI. Portanto, os macrófagos devem ser reassumatados semanalmente para transformar o modelo Calu-3 atual em um modelo de cocultura. A otimização do protocolo de cocultura está em andamento.
Dado o exposto acima, o modelo brônquico Calu-3 é um modelo adequado para exposição repetida a aerossóis de substâncias parcialmente solúveis, como produtos químicos provenientes de fumaça de cigarro e LPS. Estas substâncias solúveis induzem aumentos significativos nas respostas de citocinas nas células de Calu-3. Para testar partículas insolúveis, como o escapamento diesel e o DQ12, é necessário um modelo de cocultura, pois os macrófagos desempenham um papel crucial na indução de efeitos por exposição a partículas.
Para as exposições descritas, foram utilizadas membranas de inserção com poros de 3,0 μm. A principal razão para escolher esse tipo de inserção é que é possível testar a translocação de nanomateriais. Ao usar tamanho de poros menor de 0,4 μm, os aglomerados de partículas não serão capazes de atravessar a membrana de inserção. A desvantagem de usar um grande tamanho de poros é que as células precisam de um tempo maior para crescer confluentes e que é mais difícil visualizar a morfologia das células usando microscopia leve. Para verificar se as células formam uma monocamada confluente, o TEER deve ser >1.000 Ω x cm2 antes de iniciar uma exposição.
Em conjunto, o modelo brônquico Calu-3 apresentado aqui é adequado para uso para exposição repetida a aerossóis, pelo menos até 3 semanas. O modelo pode suportar ser cultivado e exposto através de um fluxo de ar contínuo e é capaz de detectar toxicidade ao epitélio brônquico.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é financiado pelo projeto DA UE PATROLS (Physiologicamente Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) e pelo Ministério da Saúde, Bem-Estar e Esporte holandês (projeto V/050012). Gostaríamos de agradecer à Dra.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |