Décrit est la culture cellulaire et la méthode d’exposition d’un modèle bronchique in vitro pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules pour l’essai de toxicité.
Pour les tests de toxicité des particules en suspension dans l’air, des systèmes d’exposition à l’interface air-liquide (ALI) ont été mis au point pour des tests in vitro afin d’imiter des conditions d’exposition réalistes. Cela impose des exigences spécifiques aux modèles de culture cellulaire. De nombreux types de cellules sont affectés négativement par l’exposition à l’air (p. ex., assèchement) et ne restent viables que pendant quelques jours. Cela limite les conditions d’exposition qui peuvent être utilisées dans ces modèles : des concentrations généralement relativement élevées sont appliquées sous forme de nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules, qui se déposent rapidement) dans un court laps de temps. De telles conditions expérimentales ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules. Pour surmonter ces limitations l’utilisation d’une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine, Calu-3 a été étudié. Ces cellules peuvent être cultivés à des conditions ALI pendant plusieurs semaines tout en conservant une morphologie saine et un monocouche stable avec des jonctions serrées. En outre, ce modèle bronchique est adapté pour tester les effets des expositions répétées à de faibles concentrations réalistes de particules en suspension dans l’air à l’aide d’un système d’exposition ALI. Ce système utilise un flux d’air continu contrairement à d’autres systèmes d’exposition ALI qui utilisent une seule nébulisation produisant un nuage. Par conséquent, le système de flux continu convient à une exposition répétée et prolongée aux particules en suspension dans l’air tout en surveillant en permanence les caractéristiques des particules, la concentration d’exposition et la dose administrée. Pris ensemble, ce modèle bronchique, en combinaison avec le système d’exposition continue au débit, est capable d’imiter des conditions réalistes et répétées d’exposition par inhalation qui peuvent être utilisées pour des tests de toxicité.
Les poumons sont vulnérables à l’exposition par inhalation aux particules en suspension dans l’air. Afin d’évaluer la toxicité potentielle des particules en suspension dans l’air, des progrès ont été réalisés dans le développement de systèmes d’exposition à l’interface air-liquide (ALI)1,2,3,4,5. Les systèmes d’exposition ALI permettent des modèles d’exposition plus pertinents et réalistes par rapport à l’exposition immergée traditionnelle par l’intermédiaire d’un milieu de culture qui modifie les caractéristiques et lacinétique des particules 6. Les systèmes d’exposition ALI mentent des exigences spécifiques sur les modèles de culture cellulaire, car les modèles manquent de milieu de culture et donc de nutriments sur le côté apical. De nombreux modèles cellulaires sont affectés négativement par la culture et l’exposition à l’air (p. ex., séchage) et ne demeurent viables que pendant quelques jours. Cela limite les conditions d’exposition qui peuvent être utilisées dans ces modèles : des concentrations généralement relativement élevées sont appliquées dans un court laps de temps comme nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules, qui se déposent rapidement). De telles conditions expérimentales ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules; ainsi, la pertinence des résultats peut être remise en question. Pour surmonter ces limitations, le protocole de culture et d’exposition pour un modèle bronchique composé de la lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine Calu-37 a été optimisé.
La plupart des modèles pulmonaires in vitro utilisés pour l’exposition ali contiennent d’autres lignées cellulaires telles que A549, BEAS-2B, et 16HBE14o- (16HBE) ou cellules primaires comme base8. Ces lignées cellulaires ont l’inconvénient qu’elles ne restent viables que pendant quelques jours lorsqu’elles sont cultivés à l’ALI. En outre, certaines de ces lignées cellulaires surcroissance lorsqu’elles sont cultivés pendant une période de plus de 5 jours. Enfin, les cellules A549 manquent les jonctions étroites fonctionnelles et ne peuvent donc pas former une barrière serrée qui est nécessaire pour imiter lespoumons 9,10. Les cellules épithéliales primaires pourraient être une bonne option pour l’exposition ali car elles peuvent être cultivés à l’ALI pendant des semaines. Cependant, les cellules primaires diffèrent d’un lot à l’autre, sont plus difficiles à entretenir et sont plus coûteuses que les lignées cellulaires, ce qui les rend moins adaptées aux tests de toxicité et au dépistage. Lorsque l’on compare différentes lignées cellulaires épithéliales bronchiques humaines (16HBE, Calu-3, H292 et BEAS-2B), seules les cellules Calu-3 remplissent tous les critères nécessaires à une exposition ali réaliste et répétée : elles restent viables pendant des semaines pendant leur culture à l’ALI, fournissent une intégrité de barrière élevée, ne surcroîtent pas et sont faciles à culture et à entretenir. Les cellules Calu-3 proviennent d’un adénocarcinome et sont capables de produire du mucus11,12. Il ya des incohérences quant à savoir si les cellules peuvent développer des cils11,13. Les cellules Calu-3 sont également un modèle approprié pour étudier les infections par le virus respiratoire syncytial (VRS) qui infectent les cellules épithéliales ciliées des voies respiratoires14.
Outre le modèle cellulaire, un système d’exposition automatisé (AES) est utilisé pour l’exposition air-liquide aux aérosols15,16. L’AES a l’avantage d’utiliser un flux d’air continu pour exposer le modèle cellulaire aux aérosols. Cela contraste avec d’autres systèmes d’exposition air-liquide qui utilisent habituellement des concentrations relativement élevées dans un court laps de temps comme nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules qui s’installentrapidement) 17,18,19. Ces systèmes cloud ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules. En appliquant un flux d’air continu à l’aide de l’AES, le modèle cellulaire peut être exposé à une faible concentration de particules sur une plus longue période, reflétant des conditions d’exposition réalistes. Un autre avantage par rapport aux systèmes cloud est que l’AES a la possibilité de connecter les instruments de caractérisation des particules, permettant de mesurer la taille des particules, la concentration de nombres et la masse au fil du temps. Une limitation de l’AES est qu’il utilise des débits d’air relativement élevés entre 10 mL/min et 100 mL/min.
Cet article décrit une méthode pour la culture des cellules épithéliales bronchiques humaines sous ALI et l’exposition de ce modèle bronchique aux aérosols ou aux gaz. L’avantage de l’utilisation des cellules Calu-3 est qu’elles forment des jonctions serrées, restent monocouches, sont capables de résister au flux d’air, et peuvent être cultivés pendant des semaines à l’ALI, contrairement à beaucoup d’autres types de cellules (par exemple, 16HBE, H292, et BEAS-2B). L’utilisation de la stationd’exposition automatisée vitrocell ® (AES) a l’avantage que les cellules peuvent être exposées dans des conditions réalistes et pertinentes car de faibles concentrations peuvent être appliquées à l’aide d’un flux d’air continu.
Les systèmes de flux continus, tels que l’AES, ont des avantages par rapport à l’utilisation des systèmes cloud3,32, qui utilisent une seule nébulisation d’une suspension. Le débit continu est plus réaliste et de nombreuses variables comme le débit, l’humidité et la température sont contrôlées. En outre, le dépôt peut être amélioré à l’aide d’un champ électrique. Enfin, les caractéristiques des aérosols comme la taille, la concentration des nombres et la masse sont surveillées en ligne. Un inconvénient est que les systèmes de flux continus sont plus complexes par rapport aux systèmes cloud. Par conséquent, il est important de faire des expériences préparatoires qui mettent l’accent sur les caractéristiques des particules de l’aérosol et la dose livrée sur l’insert. La concentration initiale de départ des particules et les paramètres AES peuvent ensuite être ajustés pour atteindre la dose désirée sur les cellules33. Selon le type de particules testées, la méthode de génération d’aérosols peut différer. L’utilisation de dépôts électrostatiques dépend du type de particule et fonctionne le mieux pour les particules métalliques. Pour les particules dont la charge de surface est positive, un champ électrostatique négatif doit être appliqué et vice versa.
La sélection des concentrations d’exposition peut être difficile pour toute expérience d’exposition air-liquide. Pour les expositions au DQ12, l’objectif était d’atteindre une dose cumulative totale de 1 μg/cm2 après 3 semaines d’exposition, 5 jours par semaine, 4 h par jour. Cette dose est similaire aux doses qui ont induit un effet in vivo21,25,27,32,33. Lors de l’exécution des expositions, il y avait une certaine variation entre les différents jours d’exposition. Bien que la dose réelle déposée de 1,6 μg/cm2 soit supérieure à celle de 1 μg/cm2 prévue, la dose aurait pu être trop faible pour observer les effets du modèle Calu-3. Seules des différences mineures dans la réponse teer, viabilité et cytokine ont été observées entre l’exposition à l’air pur et l’exposition au DQ12, et ces différences n’étaient pas statistiquement significatives. Une explication pour l’observation que l’exposition de DQ12 pendant 3 semaines n’a pas induit des effets significatifs dans les cellules de Calu-3 est que les macrophages manquaient du modèle de Calu-3. Peut-être, après dq12 macrophages absorption produire des cytokines pro-inflammatoires qui peuvent affecter les cellules Calu-3. Une autre explication est que le lot DQ12 qui a été utilisé pour les expériences n’était pas aussi réactif que prévu. Lors de l’utilisation du LPS comme substance de contrôle positif, Calu-3 montre une réponse, mesurée par une augmentation de la libération de LDH et une augmentation de la libération de TNF-α. Cela indique que le modèle peut détecter la toxicité.
Le modèle cellulaire Calu-3 présente de nombreux avantages, comme nous l’avons vu dans la section résultats. En outre, lorsqu’elles sont cultivés pendant une plus longue période à l’ALI, les cellules Calu-3 peuvent développer des structures cils/cils13 et produire du mucus11,12,13. Malgré ces avantages, le modèle a des limites en ce qui concerne sa pertinence physiologique. Les lignées cellulaires Calu-3 proviennent d’un adénocarcinome, tandis que 16HBE et BEAS-2B proviennent de tissus sains. Malheureusement, ces deux derniers ne conviennent pas à l’exposition répétée à l’ALI car ils ne restent pas un monocouche stable au fil du temps. Une autre limitation du modèle Calu-3 est qu’il ne représente qu’un seul type de cellule. Dans le poumon humain, plusieurs types de cellules qui interagissent et réagissent différemment à l’exposition sont présents. Les particules inhalées se déposent dans différentes régions des poumons en fonction de leur taille aérodynamique. C’est là que les particules contactent la barrière cellulaire épithéliale, comme l’imite le modèle Calu-3. Dans le poumon humain, les macrophages alvéolaires sont attirés par les particules, les engloutissent et les dégagent des poumons. Les macrophages jouent également un rôle essentiel dans la réponse de l’inflammation à l’exposition aux particules. Par conséquent, des efforts sont faits pour étendre le modèle Calu-3 en ajoutant des macrophages primaires pour imiter la barrière pulmonaire de plus près. L’inconvénient des macrophages est qu’ils restent viables seulement pendant environ 7 jours lorsqu’ils sont cultivés au-dessus des cellules Calu-3 à l’ALI. Par conséquent, les macrophages doivent être lus chaque semaine pour transformer le modèle calu-3 actuel en modèle de coculture. L’optimisation du protocole de coculture est en cours.
Compte tenu de ce qui précède, le modèle bronchique Calu-3 est un modèle approprié pour l’exposition répétée aux aérosols de substances partiellement solubles telles que les produits chimiques de la fumée de cigarette et le LPS. Ces substances solubles induisent des augmentations significatives des réponses cytokine dans les cellules Calu-3. Pour tester les particules insolubles telles que les gaz d’échappement diesel et le DQ12, un modèle de coculture est nécessaire, car les macrophages jouent un rôle crucial dans l’induction des effets par exposition aux particules.
Pour les expositions décrites, des membranes d’insertion avec des pores de 3,0 μm ont été utilisées. La raison principale du choix de ce type d’insert est qu’il est possible de tester la translocation des nanomatériaux. Lorsqu’ils utilisent de plus petits pores de 0,4 μm, les aggloméates de particules ne pourront pas traverser la membrane d’insertion. L’inconvénient d’utiliser une grande taille de pore est que les cellules ont besoin d’un temps plus long pour se développer confluent et qu’il est plus difficile de visualiser la morphologie des cellules à l’aide de microscopie légère. Pour vérifier que les cellules ne forment un monocouche confluent, le TEER doit être >1000 Ω x cm2 avant de commencer une exposition.
Pris ensemble, le modèle bronchique Calu-3 présenté ici est adapté à l’utilisation pour une exposition répétée aux aérosols, au moins jusqu’à 3 semaines. Le modèle peut résister à être cultivé et exposé par un flux d’air continu et est capable de détecter la toxicité de l’épithélium bronchique.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux sont financés par le projet PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) et le ministère néerlandais de la Santé, du Bien-être social et du Sport (projet V/050012). Nous tenons à remercier Mme Yvonne Staal et le Dr Jan van Benthem d’avoir examiné de façon critique le manuscrit.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |