描述的是体外支气管模型的细胞培养和暴露方法,用于逼真、反复吸入颗粒以进行毒性测试。
为了对空气中的颗粒进行毒性测试,已经开发了空气-液体接口(ALI)暴露系统进行体外测试,以模拟逼真的暴露条件。这就对细胞培养模型提出了具体要求。许多细胞类型受到空气暴露的负面影响(例如干燥),并且只存活几天。这限制了这些模型中可用于的暴露条件:通常相对较高的浓度在短时间内用作云(即含有粒子的液滴,它们迅速沉降)。这种实验条件并不反映长期暴露于低浓度粒子的现实情况。为了克服这些限制,使用人类支气管上皮细胞线,Calu-3进行了调查。这些细胞可以在ALI条件下培养几个星期,同时保持健康的形态和稳定的单层与紧密的交汇点。此外,此支气管模型还适用于使用 ALI 暴露系统测试反复暴露在低、逼真的空气中颗粒浓度的影响。此系统使用连续气流,与其他 ALI 暴露系统相比,该系统使用生成云的单个星云。因此,连续流系统适用于反复和长时间暴露在空气中的颗粒,同时持续监测粒子特性、暴露浓度和输送剂量。综合起来,这种支气管模型,结合连续流动暴露系统,能够模拟现实,重复吸入暴露条件,可用于毒性测试。
肺部容易吸入空气中的颗粒。为了评估空气中粒子的潜在毒性,在开发空气-液体接口(ALI)暴露系统1、2、3、4、5方面取得了进展。ALI暴露系统允许更相关和现实的暴露模型相比,传统的水下暴露通过培养基,改变粒子的特征和动能6。ALI暴露系统对细胞培养模型提出了具体要求,因为模型缺乏培养基,因此在apical方面缺乏营养物质。许多细胞模型受到培养和暴露在空气中的负面影响(例如干燥),并且只存活几天。这限制了这些模型中可用于的暴露条件:通常相对较高的浓度在短时间内作为云(即含有粒子的液滴,这些颗粒迅速沉降)。这种实验条件并不反映长期暴露于低浓度颗粒的现实情况:因此,结果的相关性是可以质疑的。为了克服这些限制,优化了由人类支气管上皮细胞系Calu-3 7组成的支气管模型的培养和暴露方案。
大多数用于ALI暴露的体外肺模型包含其他细胞系,如A549、BEAS-2B和16HBE14o-(16HBE)或原细胞作为基础8。这些细胞系的缺点是,在ALI培养时,它们只能存活几天。此外,其中一些细胞系在培养超过5天时过度生长。最后,A549细胞错过功能紧密的交汇点,因此不能形成一个紧密的屏障,需要模仿肺9,10。原发性上皮细胞可能是ALI暴露的一个很好的选择,因为它们可以在ALI培养数周。然而,原细胞因批次而异,难以维持,而且与细胞系相比成本更高,因此不太适合毒性测试和筛选。在比较不同的人类支气管上皮细胞系(16HBE、Calu-3、H292 和 BEAS-2B)时,只有 Calu-3 细胞符合现实、重复 ALI 暴露所需的所有标准:它们在 ALI 培养时保持数周存活,提供高屏障完整性,不过度生长,并且易于培养和维护。Calu-3细胞起源于腺癌,能够产生粘液11,12。细胞能否发育成西莉亚11,13,存在不一致之处。Calu-3细胞也是研究呼吸道同步病毒(RSV)感染感染气道上皮细胞14的合适模型。
除了细胞模型,自动曝光系统(AES)还用于气溶胶15,16的气液暴露。AES 的优势是它使用连续气流将细胞模型暴露在气溶胶下。这与其他空气-液体暴露系统形成鲜明对比,这些系统通常在短时间内使用相对较高的浓度作为云(即含有快速沉降的颗粒的液滴)17、18、19。这些云系统并不反映长期暴露于低浓度粒子的现实。通过使用 AES 应用连续气流,细胞模型可以在较长时间内暴露在低浓度的颗粒中,从而反映现实的暴露条件。与云系统的另一个优势是,AES 可以选择连接粒子表征仪器,从而能够测量粒子大小、数字浓度和质量。AES 的一个限制是,它使用的气流相对较高,在 10 mL/min 和 100 mL/min 之间。
本文描述了一种在ALI下培养人类支气管上皮细胞的方法,并将这种支气管模型暴露在气溶胶或气体中。使用 Calu-3 细胞的优点是它们形成紧密的交汇点,保持单层,能够承受气流,并且可以在 ALI 培养数周,与许多其他细胞类型不同(例如,16HBE、H292 和 BEAS-2B)。使用 VITROCELL® 自动曝光站 (AES) 具有在现实和相关条件下暴露细胞的优点,因为低浓度可以使用连续气流进行应用。
与使用云系统3、32相比,持续流系统(如 AES)具有优势,云系统使用单个悬架的模糊化。连续流更逼真,并控制许多变量,如流速、湿度和温度。此外,还可以使用电场增强沉积。最后,在线监控气溶胶特征,如体型、数字浓度和质量。缺点是,与云系统相比,持续流系统更为复杂。因此,重要的是要进行预备性实验,重点是气溶胶的粒子特性和插入物上的输送剂量。然后,可以调整粒子的初始启动浓度和 AES 设置,以达到33细胞上所需的剂量。根据测试的粒子类型,气溶胶生成方法可能有所不同。静电沉积的使用取决于颗粒类型,最适合金属颗粒。对于表面电荷为正的粒子,应应用负静电场,反之亦然。
对于任何气液暴露实验来说,选择暴露浓度都可能很困难。对于 DQ12 暴露,目标是在 3 周暴露后,每周 5 天,每天 4 小时,实现 1μg/cm2的总累积剂量。这种剂量类似于在体内21,25,27,32,33引起效果的剂量。在执行暴露时,不同暴露天之间存在一些差异。虽然实际沉积剂量为 1.6 μg/cm2高于目标的 1 μg/cm2,但剂量可能太低,无法观察 Calu-3 模型的影响。在清洁空气暴露和DQ12暴露之间只观察到TEER、生存能力和细胞因子反应的细微差异,这些差异在统计学上没有显著性。对DQ12暴露3周没有在Calu-3细胞中引起显著影响的观察的一个解释是,Calu-3模型缺乏巨噬细胞。可能,在DQ12吸收巨噬细胞后产生可能影响Calu-3细胞的前炎细胞因子。另一个解释是,用于实验的DQ12批次没有预期的那样被动。当使用LPS作为阳性控制物质时,Calu-3确实表现出一种反应,其衡量标准是LDH释放量的增加和TNF-α释放量的增加。这表明该模型可以检测毒性。
正如结果部分所讨论的,Calu-3细胞模型有许多优点。此外,当在ALI培养更长的时间,Calu-3细胞可以生长西莉亚/西莉亚状结构13和产生粘液11,12,13。尽管有这些优点,该模型在生理相关性方面也有局限性。Calu-3细胞系源自腺癌,而16HBE和BEAS-2B来自健康组织。不幸的是,后两个不适合重复的ALI暴露,因为它们不保持一个稳定的单层随着时间的推移。Calu-3模型的另一个局限性是,它只代表单个细胞类型。在人类肺中,存在多种细胞类型,它们与暴露不同的相互作用和反应。吸入的颗粒会沉积在肺部的不同区域,这取决于它们的空气动力学大小。这是粒子与上皮细胞屏障接触的地方,正如 Calu-3 模型所模仿的那样。在人类肺中,肺活体巨噬细胞被粒子吸引,吞没它们,并清除它们从肺部。巨噬细胞在颗粒暴露的炎症反应中也起着至关重要的作用。因此,正在努力扩展Calu-3模型,增加主要的巨噬细胞,以更密切地模仿肺屏障。巨噬细胞的缺点是,当在ALI的Cau-3细胞之上培养时,它们只能存活7天左右。因此,应每周阅读巨噬细胞,将当前的 Calu-3 模型转换为 co 文化模型。目前正在优化 co 文化协议。
鉴于上述情况,Calu-3支气管模型是反复接触部分可溶性物质(如香烟烟雾和LPS中的化学物质)气溶胶的合适模型。这些可溶性物质诱发卡鲁-3细胞细胞因子反应显著增加。为了测试不溶性颗粒,如柴油排气和DQ12,需要一个培养模型,因为巨噬细胞在粒子暴露效应的诱导中起着至关重要的作用。
对于描述的暴露,使用 3.0 μm 孔隙插入膜。选择这种类型的插入的主要原因是可以测试纳米材料的易位性。当使用较小的 0.4 μm 孔径时,粒子聚集物将无法穿过插入膜。使用大孔径的缺点是细胞需要更长的时间来生长汇合体,并且使用光显微镜更难想象细胞的形态。要检查细胞是否确实形成汇合单层,TEER 在开始暴露之前应 =1,000 Ω x cm2。
综合起来,这里介绍的 Calu-3 支气管模型适合反复暴露在气溶胶下,至少长达 3 周。该模型可以承受通过连续气流培养和暴露,并能够检测到支气管上皮的毒性。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由欧盟项目巡逻队(现实纳米材料危害的生理锚定工具)和荷兰卫生、福利和体育部(V/050012项目)资助。我们要感谢伊冯娜·斯塔尔博士和扬·范本瑟姆博士对手稿的批判性审查。
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |