Beskrevet er cellekulturen og eksponeringsmetoden for en in vitro-bronkial model til realistisk, gentagen indåndingseksponering for partikler til toksicitetstest.
Til toksicitetstest af luftbårne partikler er der udviklet luft-væske-interface (ALI) eksponeringssystemer til in vitro-test for at efterligne realistiske eksponeringsforhold. Dette stiller specifikke krav til cellekulturmodellerne. Mange celletyper påvirkes negativt af udsættelse for luft (f.eks. udtørring) og forbliver kun levedygtige i et par dage. Dette begrænser de eksponeringsbetingelser, der kan bruges i disse modeller: Normalt anvendes relativt høje koncentrationer som en sky (dvs. dråber, der indeholder partikler, som sætter sig hurtigt ned) inden for en kort periode. Sådanne forsøgsbetingelser afspejler ikke realistisk langvarig eksponering for lave koncentrationer af partikler. For at overvinde disse begrænsninger brugen af en menneskelig bronchiale epitelcelle linje, Calu-3 blev undersøgt. Disse celler kan dyrkes ved ALI-forhold i flere uger, samtidig med at de bevarer en sund morfologi og et stabilt monolag med stramme vejkryds. Desuden er denne bronchiale model egnet til at teste virkningerne af gentagen eksponering for lave, realistiske koncentrationer af luftbårne partikler ved hjælp af et ALI-eksponeringssystem. Dette system bruger en kontinuerlig luftstrøm i modsætning til andre ALI-eksponeringssystemer, der bruger en enkelt forstøvning, der producerer en sky. Derfor er det kontinuerlige strømningssystem egnet til gentagen og langvarig eksponering for luftbårne partikler, mens det kontinuerligt overvåger partikelegenskaberne, eksponeringskoncentrationen og den leverede dosis. Samlet set er denne bronchiale model i kombination med det kontinuerlige floweksponeringssystem i stand til at efterligne realistiske, gentagne inhalationseksponeringsforhold, der kan bruges til toksicitetstest.
Lungerne er sårbare over for indånding eksponering for luftbårne partikler. For at vurdere luftbårne partiklers potentielletoksiciteter der gjort fremskridt med at udvikle luftvæskeeksponeringssystemer (ALI) 1,2,3,4,5. ALI-eksponeringssystemer giver mulighed for mere relevante og realistiske eksponeringsmodeller sammenlignet med traditionel neddykket eksponering via dyrkningsmedium , der ændrer partiklernes egenskaber og kinetik6. ALI-eksponeringssystemerne stiller specifikke krav til cellekulturmodellerne, da modellerne mangler kulturmedie og dermed næringsstoffer på den apikale side. Mange cellemodeller påvirkes negativt af at blive dyrket og eksponeret i luften (f.eks. udtørring) og forbliver kun levedygtige i et par dage. Dette begrænser de eksponeringsbetingelser, der kan anvendes i disse modeller: Normalt anvendes relativt høje koncentrationer inden for en kort periode som sky (dvs. dråber, der indeholder partikler, som slår sig hurtigt ned). Sådanne forsøgsbetingelser afspejler ikke realistisk langtidseksponering for lave koncentrationer af partikler. Der kan således sættes spørgsmålstegn ved resultaternes relevans. For at overvinde disse begrænsninger blev kultur- og eksponeringsprotokollen for en bronkial model bestående af den menneskelige bronchiale epitelcellelinje Calu-37 optimeret.
De fleste in vitro-lungemodeller, der anvendes til ALI-eksponering, indeholder andre cellelinjer såsom A549, BEAS-2B og 16HBE14o- (16HBE) eller primærceller som grundlag8. Disse cellelinjer har den ulempe, at de forbliver levedygtige i kun et par dage, når de dyrkes på ALI. Derudover vokser nogle af disse cellelinjer, når de dyrkes i en periode længere end 5 dage. Endelig A549 celler glip af funktionelle stramme vejkryds og kan derfor ikke danne en stram barriere, der er nødvendig for at efterligne lungerne9,10. Primære epitelceller kan være en god mulighed for ALI eksponering, da de kan dyrkes på ALI i ugevis. Primære celler varierer imidlertid fra parti til parti, er vanskeligere at vedligeholde og er dyrere sammenlignet med cellelinjer, hvilket gør dem mindre egnede til toksicitetstest og screening. Når man sammenligner forskellige menneskelige bronchiale epitelcellelinjer (16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B), opfylder kun Calu-3-cellerne alle de kriterier, der er nødvendige for realistisk, gentagen ALI-eksponering: de forbliver levedygtige i uger, mens de dyrkes på ALI, giver en høj barriereintegritet, vokser ikke og er lette at kultur og vedligeholde. Calu-3 celler stammer fra en adenocarcinoma og er i stand til at producere slim11,12. Der er uoverensstemmelser om , hvorvidt cellerne kan udvikle cilia11,13. Calu-3 celler er også en egnet model til at studere respiratorisk syncytial virus (RSV) infektioner, der inficerer ciliated luftveje epitelceller14.
Ud over cellemodellen anvendes et automatiseret eksponeringssystem (AES) til luftvæskeeksponering for aerosoler15,16. AES har den fordel, at den bruger en kontinuerlig luftstrøm til at udsætte cellemodellen for aerosoler. Dette er i modsætning til andre luft-væske eksponeringssystemer, der normalt bruger relativt høje koncentrationer inden for en kort periode som en sky (dvs . dråber, der indeholder partikler, der sætter sig hurtigt ned)17,18,19. Disse skysystemer afspejler ikke realistisk langvarig eksponering for lave koncentrationer af partikler. Ved at anvende en kontinuerlig luftstrøm ved hjælp af AES kan cellemodellen udsættes for en lav koncentration af partikler over en længere periode, hvilket afspejler realistiske eksponeringsforhold. En anden fordel i forhold til cloud-systemer er, at AES har mulighed for at forbinde partikelkarakteriseringsinstrumenter, hvilket gør det muligt at måle partikelstørrelse, talkoncentration og masse over tid. En begrænsning af AES er, at den bruger relativt høje luftstrømme mellem 10 mL/min og 100 mL/min.
Dette papir beskriver en metode til dyrkning af humane bronchiale epitelceller under ALI og udsætte denne bronchiale model for aerosoler eller gasser. Fordelen ved at bruge Calu-3 celler er, at de danner stramme vejkryds, forbliver en monolayer, er i stand til at modstå luftstrømmen, og kan dyrkes i ugevis på ALI, i modsætning til mange andre celletyper (f.eks 16HBE, H292, og BEAS-2B). Brug af VITROCELL® automatiseret eksponeringsstation (AES) har den fordel, at cellerne kan eksponeres under realistiske og relevante forhold, da lave koncentrationer kan anvendes ved hjælp af en kontinuerlig luftstrøm.
Fortsatte flowsystemer, såsom AES, har fordele sammenlignet med at bruge skysystemer3,32, som bruger en enkelt forstøvning af en suspension. Det kontinuerlige flow er mere realistisk, og mange variabler som strømningshastighed, fugtighed og temperatur styres. Derudover kan aflejring forbedres ved hjælp af et elektrisk felt. Endelig overvåges aerosolegenskaber som størrelse, antalskoncentration og masse online. En ulempe er, at fortsatte flowsystemer er mere komplekse sammenlignet med cloud-systemer. Derfor er det vigtigt at køre forberedende eksperimenter, der fokuserer på aerosolens partikelegenskaber og den leverede dosis på indsatsen. Partiklernes første startkoncentration og AES-indstillingerne kan derefter justeres for at opnå den ønskede dosis på cellerne33. Afhængigt af den type partikler, der testes, kan aerosolgenereringsmetoden variere. Brugen af elektrostatisk aflejring afhænger af partikeltypen og fungerer bedst for metalliske partikler. For partikler med en positiv overfladeladning skal der påføres et negativt elektrostatisk felt og omvendt.
Det kan være vanskeligt at vælge eksponeringskoncentrationer for ethvert forsøg med luft-væskeeksponering. For DQ12-eksponeringerne var målet at opnå en samlet kumulativ dosis på 1 μg/cm2 efter 3 ugers eksponering, 5 dage om ugen, 4 timer om dagen. Denne dosis svarer til doser, der fremkaldte en effekt in vivo21,25,27,32,33. Ved udførelsen af eksponeringerne var der en vis variation mellem forskellige eksponeringsdage. Selv om den faktisk deponerede dosis på 1,6 μg/cm2 er højere end den 1 μg/cm2, der var beregnet til, kunne dosis have været for lav til at observere virkningerne i Calu-3-modellen. Kun mindre forskelle i TEER, levedygtighed og cytokinrespons blev observeret mellem eksponeringen for ren luft og DQ12-eksponeringen, og disse forskelle var ikke statistisk signifikante. En forklaring på observationen af, at DQ12-eksponering i 3 uger ikke fremkaldte signifikante virkninger i Calu-3-cellerne, er, at makrofager manglede fra Calu-3-modellen. Muligvis, efter DQ12 optagelse makrofager producere proinflammatoriske cytokiner, der kan påvirke Calu-3 celler. En anden forklaring er, at det DQ12-parti, der blev brugt til forsøgene, ikke var så reaktivt som forventet. Ved brug af LPS som et positivt kontrolstof viser Calu-3 et respons målt ved en stigning i LDH-frigivelsen og en stigning i TNF-α frigivelse. Dette indikerer, at modellen kan detektere toksicitet.
Calu-3 cellemodellen har mange fordele, som diskuteret i resultatafsnittet. Desuden, når dyrket i længere tid på ALI, Calu-3 celler kan vokse cilia/cilia-lignende strukturer13 og producere slim11,12,13. På trods af disse fordele har modellen begrænsninger med hensyn til dens fysiologiske relevans. Calu-3 cellelinjerne stammer fra en adenocarcinoma, mens 16HBE og BEAS-2B stammer fra sundt væv. Desværre er de to sidstnævnte ikke egnede til gentagen ALI-eksponering, da de ikke forbliver et stabilt monolag over tid. En anden begrænsning af Calu-3-modellen er, at den kun repræsenterer en enkelt celletype. I den menneskelige lunge er flere celletyper, der interagerer og reagerer forskelligt på eksponering, til stede. Inhalerede partikler vil deponere i forskellige områder af lungerne afhængigt af deres aerodynamiske størrelse. Det er her partiklerne kontakter epitelcellebarrieren, som efterlignet af Calu-3-modellen. I den menneskelige lunge tiltrækkes alveolar makrofager til partiklerne, opsluger dem og rydder dem fra lungerne. Makrofager spiller også en væsentlig rolle i betændelsesresponsen på partikeleksponering. Derfor gøres der en indsats for at udvide Calu-3-modellen ved at tilføje primære makrofager for at efterligne lungebarrieren nærmere. Ulempen ved makrofagerne er, at de kun forbliver levedygtige i ca. 7 dage, når de dyrkes oven på Calu-3-celler ved ALI. Derfor bør makrofager læses ugentligt for at omdanne den nuværende Calu-3-model til en kokulturmodel. Optimeringen af samkulturprotokollen er i øjeblikket i gang.
I betragtning af ovenstående er Calu-3 bronkialmodellen en egnet model til gentagen eksponering for aerosoler af delvis opløselige stoffer som kemikalier fra cigaretrøg og LPS. Disse opløselige stoffer fremkalder betydelige stigninger i cytokinresponser i Calu-3-cellerne. Til test af uopløselige partikler som dieseludstødning og DQ12 er der behov for en cokulturmodel, fordi makrofagerne spiller en afgørende rolle i induktionen af effekter ved partikeleksponering.
For de beskrevne eksponeringer blev der anvendt skærmembraner med 3,0 μm porer. Hovedårsagen til at vælge denne type skær er, at det er muligt at teste translokationen af nanomaterialer. Ved brug af mindre porestørrelse på 0,4 μm vil partikelreglomerater ikke kunne krydse skærmembranen. Ulempen ved at bruge en stor porestørrelse er, at cellerne har brug for længere tid til at vokse sammenløb, og at det er vanskeligere at visualisere cellernes morfologi ved hjælp af lysmikroskopi. Hvis du vil kontrollere, at cellerne udgør et sammenløbet monolag, skal TEER være >1.000 Ω x cm2, før du starter en eksponering.
Tilsammen er Calu-3 bronkialmodellen præsenteret her egnet til brug for gentagen eksponering for aerosoler, mindst op til 3 uger. Modellen kan modstå at blive dyrket og eksponeret via en kontinuerlig luftstrøm og er i stand til at opdage toksicitet for bronchiale epitel.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af EU-projektet PATROLS (Fysiologisk forankrede værktøjer til realistisk nanomaterialerisikobesvarelse) og det nederlandske ministerium for sundhed, velfærd og sport (projekt V/050012). Vi vil gerne takke Dr. Yvonne Staal og Dr. Jan van Benthem for kritisk gennemgang af manuskriptet.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |