説明は、毒性試験のために粒子への吸入を繰り返し暴露するためのインビトロ気管支モデルの細胞培養および曝露方法である。
空気粒子の毒性試験のために、空気液体界面(ALI)露光システムは現実的な露出条件を模倣するためにインビトロ試験のために開発された。これは、細胞培養モデルに特定の要求を置きます。多くの細胞タイプは空気への暴露(例えば、乾燥)によって悪影響を受け、数日間しか生存しない。これは、これらのモデルで使用できる暴露条件を制限します:通常、比較的高い濃度が雲として適用されます(すなわち、粒子を含む液滴は、急速に落ち着きます)。。このような実験条件は、低濃度の粒子への現実的な長期暴露を反映していない。これらの制限を克服するためにヒト気管支上皮細胞株の使用、Calu-3を調査した。これらの細胞は、健康な形態とタイトな接合を有する安定した単層を保持しながら、数週間のALI条件で培養することができる。さらに、この気管支モデルはALI露出システムを使用して、空気中の粒子の低い、現実的な濃度への反復暴露の効果をテストするのに適している。このシステムは、雲を生成する単一のネビュライゼーションを使用する他のALI露光システムとは対照的に、連続的な気流を使用します。したがって、連続流動システムは、粒子特性、曝露濃度、および送達用量を連続的に監視しながら、空中粒子への反復および長期の暴露に適している。この気管支モデルは、連続流動露光システムと組み合わせて、毒性試験に使用できる現実的で繰り返し吸入暴露条件を模倣することができる。
肺は、空気中の粒子への吸入暴露に対して脆弱である。空気中の粒子の潜在的な毒性を評価するために、空気液体界面(ALI)露光システム1、2、3、4、5の開発が進められている。ALI露光システムは、粒子の特性と運動を変える培養媒体を介した従来の水没露光と比較して、より関連性の高い現実的な露光モデルを可能にする6.ALI露光システムは、細胞培養モデルに特定の要求を課します, モデルは、培養培地を欠いているため、したがって、補助側の栄養素.多くの細胞モデルは、空気中で培養および暴露されることによって悪影響を受け(例えば、乾燥)、数日間だけ生存可能なままである。これは、これらのモデルで使用できる暴露条件を制限します:通常、比較的高い濃度が雲として短期間(すなわち、粒子を含む液滴、急速に落ち着く)として適用されます。このような実験条件は、粒子の低濃度への現実的な長期暴露を反映していません。したがって、結果の関連性を問われる可能性があります。これらの制限を克服するために、ヒト気管支上皮細胞系Calu-3-7からなる気管支モデルの培養および曝露プロトコルが最適化された。
ALI曝露に用いられるほとんどのインビトロ肺モデルは、A549、BEAS-2B、および16HBE14o—(16HBE)またはプライマリ細胞を基底8として含む他の細胞株を含む。これらの細胞株は、ALIで培養した場合、わずか数日間生存可能であるという欠点を有する。また、これらの細胞株の一部は、5日よりも長い期間培養すると過剰増殖する。最後に、A549細胞は機能的なタイトな接合部を見逃し、したがって肺9、10を模倣するために必要な堅い障壁を形成することはできません。原発性上皮細胞は、ALIで数週間培養できるため、ALI曝露に適した選択肢となる可能性があります。しかし、一次細胞はバッチによって異なり、維持が難しく、細胞株に比べて高価であり、毒性試験やスクリーニングにはあまり適していません。異なるヒト気管支上皮細胞株(16HBE、Calu-3、H292、およびBEAS-2B)を比較すると、Calu-3細胞だけが現実的で繰り返されるALI暴露に必要なすべての基準を満たしている:彼らはアリで培養しながら数週間生存可能であり、高いバリア完全性を提供し、成長し、培養し、維持しやすい。カル3細胞は腺癌に由来し、粘液11,12を産生することができる。細胞が繊毛11,13を発症できるかどうかについては矛盾がある。Calu-3細胞はまた、毛様化気道上皮細胞14に感染する呼吸間性ウイルス(RSV)感染を研究するのに適したモデルである。
セルモデルに加えて、エアゾル15,16への空気液体暴露には自動暴露システム(AES)が使用される。AESには、連続気流を使用してセルモデルをエアロゾルに公開できるという利点があります。これは、通常、雲として短期間で比較的高濃度を使用する他の空気液体暴露システム(すなわち、急速に沈降する粒子を含む液滴)17、18、19とは対照的である。これらのクラウド システムは、パーティクルの低濃度への現実的な長期暴露を反映していません。AES を使用して連続的な気流を適用することで、現実的な露光条件を反映して、より長い期間にわたって、低濃度のパーティクルにセル モデルを露出させることができます。クラウドシステムに対するもう1つの利点は、AESが粒子の特性測定器を接続するオプションを持ち、粒子サイズ、数濃度、質量を時間の経過とともに測定できる点です。AESの制限は、10 mL/minと100 mL /minの間の比較的高い空気流量を使用していることです。
本論文では、ALIの下でヒト気管支上皮細胞を培養し、この気管支モデルをエアロゾルやガスにさらす方法について述べている。Calu-3細胞を使用する利点は、それらがタイトな接合部を形成し、単層のままで、空気の流れに耐えることができ、そして他の多くの細胞タイプ(例えば、16HBE、H292、およびBEAS-2B)とは異なり、ALIで何週間も培養できることである。VITROCELL®自動露光ステーション(AES)を使用すると、連続気流を使用して低濃度を適用できるため、現実的かつ関連する条件下で細胞を露出させることができるという利点があります。
AESのような継続フローシステムは、サスペンションの単一のネビュライゼーションを使用するクラウドシステム3、32を使用する場合と比較して利点があります。連続流量はより現実的であり、流量、湿度、温度などの多くの変数が制御されます。また、電界を用いて堆積を強化することができます。最後に、サイズ、数濃度、質量などのエアロゾル特性をオンラインで監視します。欠点は、継続的なフローシステムがクラウドシステムに比べて複雑になることです。したがって、エアロゾルの粒子特性と挿入物に対する投与量に焦点を当てた準備実験を行うことが重要である。粒子の初期開始濃度とAES設定は、細胞33上で所望の線量を達成するように調整することができる。試験される粒子の種類によって、エアロゾルの生成方法が異なる場合があります。静電堆積の使用は、粒子の種類に依存し、金属粒子に最適です。正の表面電荷を持つパーティクルの場合は、負の静電場を適用し、その逆も同様です。
露光濃度の選択は、空気液体暴露実験では困難です。DQ12曝露の目的は、3週間の曝露後に1μg/cm2の総累積用量を達成することであった。この用量は、生体内21、25、27、32、33で効果を誘発した用量に似ています。露光を行う場合、露光日の違いはある程度のばらつきがあった。1.6 μg/cm2の実際の沈着線量は、目的とした1μg/cm2よりも高いが、Calu-3モデルの効果を観察するには低すぎる可能性がある。クリーンエア露光とDQ12曝露の間にはTEER、生存率、サイトカイン応答のわずかな違いのみが認められ、これらの差は統計的に有意ではなかった。3週間のDQ12曝露がカル3細胞に有意な効果を誘導しなかったという観察の説明は、マクロファージがCalu-3モデルから欠けていたことである。おそらく、DQ12取り込み後マクロファージは、カル3細胞に影響を与える可能性のある炎症性サイトカインを産生する。もう一つの説明は、実験に使用されたDQ12バッチが期待したほど反応性ではなかったということです。LPSを陽性対照物質として使用する場合、Calu-3は、LDH放出の増加およびTNF α放出の増加によって測定される応答を示す。これは、モデルが毒性を検出できることを示します。
Calu-3 細胞モデルには、結果セクションで説明されているように、多くの利点があります。さらに、ALIでより長い時間培養すると、Calu-3細胞は繊毛状/繊毛様構造13を成長させ、粘液11、12、13を産生することができる。これらの利点にもかかわらず、モデルは、その生理学的関連性に関して制限を有する。カル3細胞株は腺癌に由来し、16HBEおよびBEAS-2Bは健康な組織に由来する。残念ながら、後者の2つは、時間の経過とともに安定した単層のままであるわけではないので、繰り返しALI暴露には適していません。Calu-3 モデルのもう 1 つの制限は、単一のセル型のみを表す点です。ヒト肺では、接触し、暴露に対して異なる反応を示す複数の細胞型が存在する。吸入粒子は、空気力学的な大きさに応じて、肺の異なる領域に沈着する。これは、粒子がカル3モデルによって模倣されるように、上皮細胞の障壁に接触する場所です。ヒト肺では、肺胞マクロファージが粒子に引き付けられ、それらを巻き込み、肺から取り除く。マクロファージはまた、粒子暴露に対する炎症反応に不可欠な役割を果たす。したがって、肺バリアをより密接に模倣するために一次マクロファージを追加することによってCalu-3モデルを拡張する努力がなされている。マクロファージの欠点は、ALIでカル3細胞の上に培養した場合、約7日間のみ生存可能であり続ける点である。したがって、マクロファージは、現在のCalu-3モデルをコカルチャーモデルに変換するために毎週再追加する必要があります。コカルチャープロトコルの最適化は現在進行中です。
上記を考えると、Calu-3気管支モデルは、タバコの煙やLPSからの化学物質などの部分的に可溶性物質のエアロゾルへの繰り返し暴露のための適切なモデルです。これらの可溶性物質は、カル3細胞におけるサイトカイン応答の有意な増加を誘導する。ディーゼル排気やDQ12などの不溶性粒子の試験には、マクロファージが粒子暴露による効果の誘導において重要な役割を果たすため、共培養モデルが必要です。
記載された露光については、3.0μmの孔を有する挿入膜が使用された。このタイプの挿入を選択する主な理由は、ナノ材料の転位をテストすることができるということです。0.4μmの細孔径を使用する場合、粒子凝集体は挿入膜を横切ることができない。大きな孔サイズを使用することの欠点は、細胞がコンフルエント成長するためにより長い時間を必要とし、光顕微鏡を使用して細胞の形態を視覚化することがより困難であるということです。セルがコンフルエント単層を形成することを確認するには、露出を開始する前に TEER を >1,000 Ω x cm2 にする必要があります。
まとめると、ここで提示されるCalu-3気管支モデルは、少なくとも3週間まで、エアロゾルへの反復暴露に使用するのに適しています。このモデルは、連続気流を介して培養および暴露されることに耐えることができ、気管支上皮への毒性を検出することができます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、EUプロジェクトPATROLS(現実的なナノ材料ハザードアセスメントのための生理学的に固定されたツール)とオランダの厚生・福祉・スポーツ省(プロジェクトV/050012)によって資金提供されています。イヴォンヌ・スタール博士とヤン・ファン・ベンテス博士が原稿を批判的に見直してくれたことに感謝します。
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |