Summary
Dit protocol beschrijft stappen die nodig zijn voor de genafgifte door middel van gerichte ultrasone bloed-hersenbarrière (BBB) opening, evaluatie van de resulterende genexpressie en meting van neuromodulatie-activiteit van chemogenetische receptoren door middel van histologische tests.
Abstract
Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) maakt de niet-invasieve controle van specifieke neurale circuits mogelijk. ATAC bereikt een dergelijke controle door een combinatie van gerichte echografie (FUS) geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO), genafgifte met adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren en activering van cellulaire signalering met gemanipuleerde, chemogenetische, eiwitreceptoren en hun verwante liganden. Met ATAC is het mogelijk om zowel grote als kleine hersengebieden met millimeterprecisie te transduceren met behulp van een enkele niet-invasieve ultrasone toepassing. Deze transductie kan later een langdurige, niet-invasieve, apparaatvrije neuromodulatie mogelijk maken bij vrij bewegende dieren die een medicijn gebruiken. Aangezien FUS-BBBO, AAV's en chemogenetica bij meerdere dieren zijn gebruikt, moet ATAC ook schaalbaar zijn voor gebruik bij andere diersoorten. Dit artikel borduurt voort op een eerder gepubliceerd protocol en schetst hoe de genafgifte met FUS-BBBO naar kleine hersengebieden kan worden geoptimaliseerd met MRI-begeleiding, maar zonder dat een gecompliceerd MRI-compatibel FUS-apparaat nodig is. Het protocol beschrijft ook het ontwerp van muisgerichte en fixatiecomponenten die door elk laboratorium kunnen worden 3D-geprint en gemakkelijk kunnen worden aangepast voor verschillende soorten of aangepaste apparatuur. Om de reproduceerbaarheid te bevorderen, beschrijft het protocol in detail hoe de microbubbels, AAV's en venapunctie werden gebruikt bij de ontwikkeling van ATAC. Ten slotte worden voorbeeldgegevens getoond die de vooronderzoeken van studies met ATAC begeleiden.
Introduction
Het gebruik van circuitspecifieke neuromodulatietechnologieën, zoals optogenetica1,2 en chemogenetica 3,4,5, heeft ons begrip van psychiatrische aandoeningen als neuronale circuitstoornissen verbeterd. Neuronale circuits zijn moeilijk te bestuderen en nog moeilijker te beheersen bij de behandeling van hersenaandoeningen omdat ze meestal worden gedefinieerd door specifieke celtypen, hersengebieden, moleculaire signaalroutes en timing van activering. Idealiter voor zowel onderzoek als klinische toepassingen zou een dergelijke controle niet-invasief worden uitgeoefend, maar het bereiken van zowel nauwkeurige als niet-invasieve neuromodulatie is een uitdaging. Bijvoorbeeld, terwijl neuroactieve geneesmiddelen de hersenen niet-invasief kunnen bereiken, missen ze ruimtelijke specificiteit door in de hersenen te werken. Aan de andere kant kan elektrische diepe hersenstimulatie specifieke hersengebieden beheersen, maar heeft het moeite met het beheersen van specifieke celtypen en vereist het een operatie en plaatsing van het apparaat6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) biedt neuromodulatie met ruimtelijke, celtype en temporele specificiteit. Het combineert drie technieken: gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO) voor ruimtelijke targeting, gebruik van adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) om niet-invasieve genen af te leveren onder controle van celtypespecifieke promotors, en gemanipuleerde chemogenetische receptoren om getransfecteerde neurale circuits selectief te moduleren via toediening van geneesmiddelen. FUS is een door de FDA goedgekeurde technologie die gebruik maakt van het vermogen van echografie om diep in weefsels, inclusief het menselijk brein, met millimeter ruimtelijke precisie te focussen. Bij hoog vermogen wordt FUS gebruikt voor niet-invasieve gerichte ablatie, inclusief een door de FDA goedgekeurde behandeling voor essentiële tremor8. FUS-BBBO combineert echografie met lage intensiteit met systemisch toegediende microbubbels, die oscilleren in bloedvaten bij de ultrasone focus, wat resulteert in gelokaliseerde, tijdelijke (6-24 uur) en omkeerbare opening van de BBB9. Deze opening zorgt voor de afgifte van eiwitten 9,10, kleine moleculen11 en virale vectoren7,12,13,14 aan de hersenen zonder significante weefselschade bij knaagdieren 10 en niet-menselijke primaten 15. Klinische studies zijn aan de gang voor FUS-BBBO16,17, wat wijst op mogelijke therapeutische toepassingen van deze techniek.
Virale genafgifte met behulp van AAV vordert ook snel in klinisch gebruik voor CZS-aandoeningen, met recente FDA- en EU-wettelijke goedkeuringen als belangrijke mijlpalen. Ten slotte worden chemogenetische receptoren18, zoals Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), veel gebruikt door neurowetenschappers om farmacologische controle te bieden over neuronale excitatie bij transgene of getransfecteerde dieren19,20. DREADDs zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) die genetisch zijn gemanipuleerd om te reageren op synthetische chemogenetische moleculen in plaats van endogene liganden, zodat systemische toediening van deze liganden de prikkelbaarheid van DREADD-tot expressie brengende neuronen verhoogt of vermindert. Wanneer deze drie technologieën worden gecombineerd in ATAC, kunnen ze worden gebruikt voor de niet-invasieve modulatie van geselecteerde neurale circuits met ruimtelijke, celtype en temporele precisie.
Hier breiden we een eerder gepubliceerd protocol voor FUS-BBBO11 uit en werken we dit bij door een methodologie op te nemen voor het nauwkeurig richten van hersengebieden met FUS-BBBO in muizen met behulp van eenvoudige 3D-geprinte targetingapparatuur. We tonen ook een toepassing van FUS-BBBO op ATAC. We tonen stappen die nodig zijn voor de levering van AAV's met chemogenetische receptoren en evaluatie van genexpressie en neuromodulatie door histologie. Deze techniek is met name toepasbaar voor het richten op grote of meerdere hersengebieden voor genexpressie of neuromodulatie. Een groot gebied van een cortex kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden getransduceerd met FUS-BBBO en gemoduleerd met behulp van chemogenetica. Genafgifte met een alternatieve techniek, intracraniële injecties, zou echter een groot aantal invasieve injecties en craniotomieën vereisen. FUS-BBBO en de toepassing ervan, ATAC, kunnen worden geschaald naar dieren van verschillende groottes, waar hersengebieden groter zijn en moeilijker invasief te richten.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd onder een protocol dat was goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het California Institute of Technology, waar de gegevens oorspronkelijk werden verkregen door J.O.S.
1. Ontwerp en 3D-printen van dierenharnassen en beeldgeleidingshardware
- Gebruik de bestanden van de Szablowski lab website op: https://www.szablowskilab.org/downloads voor 3D-printen van de componenten.
- Zorg ervoor dat het printmateriaal een lage gevoeligheid heeft voor MRI, maar een MRI-zichtbare ondersteuning heeft. Zie de details van de gebruikte materialen in de sectie materialen en reagentia.
- Houd rekening met de materiaaldegradatie bij meerdere toepassingen door het materiaal herhaaldelijk te testen en de slijtageplaatsen te observeren die moeten worden versterkt. Zorg ervoor dat de geprinte wanden minstens 2 mm dik zijn.
- Gebruik zeer nauwkeurige 3D-printers om de targetingprecisie te verbeteren.
- Ga de zwaartekracht en andere krachten tegen om afwijking van plastic 3D-geprinte componenten te voorkomen door de componenten over hun lengte te ondersteunen en de dikte van de 3D-geprinte wanden te vergroten als er een buiging wordt waargenomen.
- Houd rekening met precisie in meerdere assen, waaronder voorste / achterste, mediale / laterale, dorsale / ventrale, evenals gier, toonhoogte en kanteling.
- Test de nauwkeurigheid van targeting door FUS-BBBO uit te voeren en de afwijking van de beoogde positie te registreren.
- Als u gemotoriseerde stereotaxische systemen gebruikt, evalueer dan op de effecten van dynamische beweging op de materiaalelasticiteit door de FUS-BBBO-targetingprocedure op video vast te leggen en corrigeer eventuele afwijkingen door de wanden van 3D-geprint materiaal te verdikken.
2. Beschrijving van het echografiesysteem
- Gebruik een ultrasoon systeem met een acht-elementen ringvormige array-transducer (diameter = 25 mm, natuurlijk brandpunt = 20 mm; diafragma (F) = 0,8)) en koppel de behuizing aan het hoofd met ontgaste ultrasone gel door gel aan te brengen op de geschoren muizenkop.
OPMERKING: De middenfrequentie van een transducer die in een eerdere studiewerd gebruikt 7 was 1,5 MHz, de pulsduur was 10 ms en de pulsherhalingsfrequentie was 1 Hz over 120 s. De drukken werden gekalibreerd met behulp van optische vezel hydrofoon en gehandhaafd tussen 0,36-0,45 MPa. Ga uit van 18% akoestische demping door de schedel21 voor 1,5 MHz en pariëtaal bot. De reeks voorwaarden die geschikt zijn voor een veilige BBB-opening en AAV-levering zijn elders in detail beschreven 7,14,22.
3. Voorbereiding van dieren
- Verdoof één muis met isofluraaninhalatie bij 2% met lucht van medische kwaliteit. Controleer de diepte van de anesthesie door een aanraking knijpen om het gebrek aan respons te bevestigen. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen met behulp van een steriele q-tip voor eenmalig gebruik om kruisbesmetting van de zalfbuis te voorkomen.
OPMERKING: Typische procedure van FUS-BBBO kan variëren van 30 minuten tot 2 uur, en anesthesie moet gedurende de hele periode worden gehandhaafd. - Nadat de muis is verdoofd, wast u een schone katheter met een gehepariniseerde zoutoplossing (10 E/ml).
OPMERKING: Een geschikte katheter voor een muis van 25-35 g heeft een naald van 30 G en een PE10-slang. - Desinfecteer vervolgens muizenstaart met 70% ethanol pad. Plaats de staartaderkatheter in een laterale staartader en zet deze vast met een weefsellijm. Observeer een terugstroom van bloed uit de staartader naar de katheter om de plaatsing ervan te bevestigen.
- Scheer de muizenkop en gebruik vervolgens ontharingscrème nadat de weefsellijm is opgedroogd om de kans te verkleinen dat luchtbellen tijdens insonatie onder ultrasone gel worden gevangen.
- Plaats de muis in een 3D-geprinte MRI-wagen, monteer de voortanden op een bijtbalk en kop in een neuskegel (figuur 1a).
- Injecteer tot 10 μL lidocaïne subcutaan op de plaats die in contact komt met de stompe oorbalken. Bevestig vervolgens de stompe staven aan de schedel en oefen veilige hoeveelheden druk uit, zorg ervoor dat u geen druk uitoefent op de luchtpijp omdat dit de ademhaling belemmert. Observeer de ademhaling gedurende 30 s om te bevestigen dat het dier vrij ademt met een snelheid van 1/s.
- Sluit de richtgids aan op oorbalken, controleer de ademhaling zoals in stap 3.6 (figuur 1b) en blijf de ademhaling elke minuut visueel volgen tijdens de procedure. Een ademhalingsfrequentie verhoogd boven 1 /s is een van de indicaties van verlies van anesthesie. Blijf de teenknijprespons elke 5 minuten controleren wanneer muizen niet in de MRI-scanner zitten of als de ademhalingsfrequentie hoger is dan 1/s.
- Breng de MRI-wagen over in een MRI-houder en vervolgens in de boring van een magneet.
OPMERKING: Het ontwerp van de hardware is geoptimaliseerd voor een spoel van 72 mm in een 7T MRI. - Verkrijg een MRI-sequentie om de muis in de scanner te lokaliseren.
- Selecteer de 3D fast low angle shot (FLASH)-reeks om de volledige hersenen te verkrijgen, met behulp van de volgende parameters, volgens specifieke instructies van de instrumentfabrikant. Echotijd: 3,9 ms, Herhalingstijd: 15 ms, Excitatiepulshoek: 15°, Matrixgrootte: 130 x 130 x 114, Resolutie: 350 x 200 x 200 μm per voxel, Gemiddelden: 1, Acquisitietijd: 3 min 42s
- Breng bestanden over van het MRI-systeem naar een computer die FUS-systeem bestuurt.
- Open de beeldvormingssequentie in de software om MRI-geleide targeting uit te voeren, waarbij het beeld moet verschijnen zoals in figuur 1c.
4. MRI-geleide targeting
OPMERKING: Met het gebruik van op maat ontworpen targetinggidsen is het niet nodig om een ultrasone transducer in een MRI te plaatsen, noch is het nodig om de huid in te snijden om targeting uit te voeren door de stereotaxis op bregma- en lambda-lijnen op nul te zetten. Volg de onderstaande stappen om het targetingproces uit te voeren.
- Plaats de wagen in een stereotaxisch instrument. Bevestig het op zijn plaats met behulp van een metalen blok met een dubbelzijdige tape en door de wagen tegen twee steunpalen van het stereotaxische instrument te drukken.
- Breng MRI-beelden over naar een computer met een actieve FUS-begeleidingssoftware door bestanden te selecteren in gegevensbeheer, met de rechtermuisknop te klikken om menuopties weer te geven en 'Onmiddellijk overzetten' te selecteren.
- Open de FUS-geleidingssoftware en laad de afbeelding door op 'Sequentie openen' te klikken en alle bestanden van de beeldsequentie te laden.
- Formatteer de afbeelding opnieuw naar drie assen door met de rechtermuisknop op 'Opnieuw formatteren' te drukken.
- Lokaliseer de transducer naar de cirkelvormige targetinggids (afbeelding 1c) door met de rechtermuisknop te klikken.
- Pas in de sagittale weergave de verticale positie van een virtuele transducer aan om rekening te houden met de dikte van het waterbad en de behuizing van de transducer (in dit geval - 8,2 mm naar boven, figuur 1d).
- Wijs de gebieden aan die moeten worden getarget in de trajectplanner en noteer de coördinaten in een spreadsheet (in dit geval middenhersenen, zoals in figuur 1d).
- Kies de gewenste diepte van targeting (z-waarde in elektronisch traject (figuur 2) en noteer coördinaten in een spreadsheet.
- Richt je op elk van de punten door op 'Traject verzenden' en 'Uitvoeren' te drukken (figuur 2).
OPMERKING: Dit wordt gedaan wanneer een muisdrager in de motoren wordt geplaatst. Dezelfde targeting kan echter met hoge nauwkeurigheid worden bereikt op een stereotaxisch instrument. - Om de coördinaten van een MRI te correleren met het stereotaxische frame, plaatst u de op maat gemonteerde transducer over een richtgeleider en vertaalt u totdat elk van de drie richtbouten (figuur 3, element A) door zowel de transducerhouder (figuur 3, element B) als de richtgeleider (figuur 3, element C) kan gaan. Controleer of de bouten niet onder spanning staan of kantelen.
- Vertaal de transducer 10,56 mm naar voren in voorste/achterste richting totdat deze zich op dezelfde plaats bevindt waar een midden van een richtgeleider op een MRI verschijnt.
- Bepaal de afstand van een middelpunt van de virtuele transducer (figuur 3a, element A) tot het doelgebied (figuur 3a, element B) en verplaats de transducer naar deze coördinaten met behulp van stereotaxisch frame.
- Ga verder met de bereiding van de injectie-oplossing.
5. Bereiding van de injectieoplossing
OPMERKING: De microbubbeloplossingen zijn zeer gevoelig voor druk. Bijgevolg kan krachtig mengen of snelle injectie door dunne naalden de microbubbels instorten en de werkzaamheid van BBB-opening verminderen. Bovendien zijn microbubbels lichter dan water en kunnen ze naar de bovenkant van een buis, katheter of spuit drijven (figuur 4), bijvoorbeeld in een automatische injector. Het wordt sterk aanbevolen om microbubbeloplossing onmiddellijk voor elke injectie te resuspenderen.
- Zuig 0,8 ml zoutoplossing op met een spuit in een tube van 1,5 ml.
- Voeg met een spuit 0,1 ml MRI-contrastmiddel toe aan dezelfde buis van 1,5 ml en meng.
- Breng de niet-geactiveerde microbubbel23,24 oplossing op kamertemperatuur.
- Activeer vlak voor de insonatie microbubbels gedurende 45 s in een microbubbel-activeringsapparaat.
- Trek langzaam (meer dan ~ 3 s) 0,1 ml microbubbels op met behulp van een 1 ml tuberculinespuit en een naald van 21 g uit de middelste diepte van een vloeistof.
- Voeg 0,08 ml microbubbels toe aan de oplossing van contrastmiddel en zoutoplossing bereid in stap 5.3. Meng door 15 s met de hand te tikken.
- Met een uiteindelijke concentratie van AAV's van 0,5-2 x 10 10 virale deeltjes per gram lichaamsgewicht (VP/g), injecteert u de lading voor levering (in dit geval AAV9) via een naald van30 G in de staartaderkatheter, in het geval van ATAC – AAV's met chemogenetische receptoren, of een negatieve controle, zoals AAV's die GFP onder dezelfde promotor dragen.
- Meng microbubbels opnieuw met de hand gedurende 15 s om drijven te voorkomen (figuur 4).
- Zuig onmiddellijk daarna 200 μL van de microbubbeloplossing op door een spuit zonder naald. Het ontbreken van een naald zal de schuifkrachten op microbubbels verminderen.
- Keer de spuit om en meng door de zuiger op en neer te drukken.
- Bevestig de naald van 30 G en duw, terwijl deze nog steeds omgekeerd is, de microbubbels langzaam naar buiten totdat er druppeltjes aan het einde van een naald verschijnen.
6. Insonatieprocedure
- Stel de parameters voor insonatie in: 10 ms pulsduur, 120 herhalingen, elke s en 0,30-0,45 MPa druk op de schedel.
- Verwijder de richtgeleider en breng ontgaste ultrasone gel aan op de muiskop, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
- Laat de transducer zakken en plaats deze direct op de oorbalkhouder en kies de coördinaten in de stereotaxische instrumenten (figuur 5).
- Injecteer de oplossing van AAV (0,5-2 x 1010 VP/g).
- Meng microbubbels en de MRI-contrastmiddeloplossing gedurende 15 s en injecteer in 80 μL per 30 g muis.
- Breng onmiddellijk echografie aan gedurende 120 s door op 'Verzenden' en 'Uitvoeren' te drukken.
- Als meer dan één site is getarget, verplaatst u de transducer naar die site en past u de dieptetargeting aan volgens de volgende getallen in de spreadsheet uit stap 4.7-4.9. Herhaal vervolgens stap 6.5-6.6 voor elke insonerende site.
7. MRI-evaluatie van BBB-opening
OPMERKING: De MRI-evaluatie van de BBB-opening is elders in detail beschreven11. De locatie van BBB-opening kan worden gevisualiseerd als helderdere gebieden bij muizen die een injectie van een T1-gewogen Gd-contrastmiddel hebben gekregen.
- Neem na de echografie een MRI-sequentie op zoals in stap 3.10.
- Verwijder de muis uit de MRI-scanner en plaats deze in een herstelkooi om herstel van anesthesie mogelijk te maken. Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood, gewichtsverlies of andere humane eindpunten. Raadpleeg veterinair personeel en de institutionele IACUC-richtlijnen om door te gaan met elke behandeling als er onverwachte bijwerkingen optreden.
8. GEVREESDE stimulatie met een chemogenetisch ligand
- Kies een chemogenetische receptor. Kies voor DREADDs de hM3Dq-receptor voor neuronale activering via Gq-gekoppelde routes19, de hM4Di-receptor voor remming van neuronale activiteit via Gi / o-gekoppelde routes20, of de KORD-receptor voor activering van neuronen via Gs-gekoppelde routes met Salvinorin-B-ligand25.
- Los clozapine-n-oxide (CNO) op in steriele zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml. Bewaar de gealiquoteerde CNO bij -20 °C.
- Dien CNO19, of een andere chemogenetische ligand26,27,28, toe via intraperitoneale route bij een concentratie tussen 0,3 – 10 mg/kg.
- Als effecten van CNO op gedrag moeten worden geregistreerd, begin dan met het registreren van de gedragsactiviteit binnen 15-45 minuten na toediening van het geneesmiddel om de maximale activering van DREADDs19 te bereiken.
- Als analyse van neuronale activering gewenst is, gebruik dan muizen voor histologische evaluatie na 60-120 minuten na injectie.
- Ga over tot euthanasie door middel van hartperfusie (zie rubriek 9).
9. Histologische evaluatie van genexpressie en chemogenetische activatie
OPMERKING: Zodra het experimentele eindpunt (bijv. einde van gedragsstudie, tijd die nodig is voor genexpressie) is bereikt, is het van cruciaal belang om de locatie en aanwezigheid van de genexpressie te bevestigen.
- Na activering met een chemogenetisch ligand, voer hartperfusie uit om weefsels te behouden.
- Verdoof de muis met ketamine (100 mg/kg) /Xylazine (10 mg/kg) mengsel in steriele zoutoplossing door middel van een IP-injectie. Bevestig de anesthesie met een teenknijper en zorg ervoor dat de ademhalingsfrequentie is verlaagd tot ongeveer 1/s. Zorg voor thermische ondersteuning via het verwarmingskussen tot de bevestiging van euthanasie.
- Bereid 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) en PBS met 10 eenheden heparine per ml.
OPMERKING: Oplossingen moeten bij 4 °C zijn. - Giet elke buffer in afzonderlijke buizen van 50 ml en sluit deze aan en bereid een peristaltische pomp voor die is aangesloten op een vlinderkatheter van 25 G met PBS / heparine-oplossing.
- Bevestig de ledematen aan een absorberende blauwe pad met tape en zorg ervoor dat het dier in rugligging op het kussen wordt geplaatst. Desinfecteer de vacht om kruisbesmetting van perifere organen te voorkomen voor het geval ze moeten worden verzameld.
- Open de peritoneale holte door een transversale incisie, waardoor het diafragma wordt blootgesteld.
- Open de ribbenkast door twee sneden chirurgische schaar langs de voorste / achterste as.
- Stel het hart bloot en plaats de naald in een linkerkamer (rechterkant van het hart zoals liggend gezien) en plaats de vlinderkatheter in stap 9.1.3.
- Maak een kleine incisie in de rechter ventrikel om bloeduitstroom mogelijk te maken.
- Zet de peristaltische pomp aan om te beginnen met het wegspoelen van het bloed met PBS / heparine.
OPMERKING: Als deze stap niet adequaat wordt uitgevoerd, zal het bloed stollen tijdens fixatie met formaline en de juiste perfusie voorkomen. - Nadat al het bloed is weggespoeld en heldere PBS uit de rechterkamer begint te komen, schakelt u de inlaat van een peristaltische pomp over naar een NBF-oplossing en begint u met perfusie gedurende 25 ml per muis.
- Extraheer de hersenen, plaats in ten minste 4 ml NBF en post-fix gedurende 24 uur.
- Sectie de hersenen met behulp van coronale secties op een vibratoom met een dikte van 50 μm sectie.
- Plaats elke sectie in een put van een 24-putplaat die de secties in de hersenen opslaat.
- Evalueer de expressie van de chemogenetische receptoren gefuseerd met fluorescerende eiwitten (bijv. mCherry of mCitrine), onder een fluorescerende microscoop om de secties te identificeren die expressie tonen om de locatie te bevestigen. De uitdrukking is waarschijnlijk zwak.
- Voer immunokleuring uit tegen de fluorofoor met behulp van het volgende protocol:
- Plaats 3 secties in 0,5 ml oplossing met 10% serum van een gastheer van een secundair antilichaam en incubeer gedurende 30 minuten.
- Breng de secties over in een oplossing van een primair antilichaam met een verdunning van 1:250 – 1:1.000, met 1:500 als uitgangspunt.
- Incubeer de secties met primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C in een microplaat afgesloten met een paraffinefilm.
- Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer.
- Voeg 0,5 ml per putje van de secundaire antilichaamoplossing toe in 10% serum.
- Incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
- Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer.
- Monteer op dia's met een waterig montagemedium dat een nucleaire vlek bevat (bijv. DAPI).
- Evalueer de lokalisatie en verspreiding met behulp van een confocale microscoop door een tegelscan van een hele sectie uit te voeren.
- Evalueer de intensiteit van expressie door de fluorescentiepixelintensiteit in gerichte hersengebieden te meten en te vergelijken met een intracranieel geïnjecteerde controle.
- Als alternatief, evalueer het percentage positieve neuronen door cellen te tellen die zijn gekleurd tegen chemogenetische receptoren, in vergelijking met DAPI-positieve cellen of celspecifieke markers.
- Evalueer de weefselschade door hematoxylinekleuring uit te voeren op een sectie van 50 μm en beeldvorming voor het verlies van cellen, ophoping van celresten en andere tekenen van grove schade.
- Om de specificiteit van celtargeting te evalueren, voert u dubbele immunostaining uit zoals hieronder beschreven voor de chemogenetische receptor en een celspecifieke marker. Voer vervolgens celpositieve tellingen uit zoals in stap 9.8.
- Plaats 3 secties in 0,5 ml van een oplossing met 10% serum van een gastheer van een secundair antilichaam en incubeer gedurende 30 minuten.
- Breng de secties over in een oplossing van een primair antilichaam tegen een fluorescerende marker van een chemogenetische receptor bij 1:250 – 1:1.000 verdunning, met 1:500 als uitgangspunt. Voeg een tweede primair antilichaam toe van een andere gastheersoort dat is gericht tegen een celspecifieke marker van belang (bijv. CamkIIa).
- Incubeer de secties met primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C in een microplaat afgesloten met paraffinefilm.
- Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer.
- Voeg 0,5 ml per put secundaire antilichaamoplossing toe aan 10% serum van de gastheersoort van beide secundaire antilichamen.
OPMERKING: Elk antilichaam moet een afzonderlijke fluorofoor hebben en moet reactief zijn tegen primaire antilichamen in stap 9.10.2. - Incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
- Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer.
- Monteer op dia's en bevestig met een waterig montagemedium dat een nucleaire vlek bevat.
10. Evalueer neuronale activatie met immunostaining voor c-Fos
- Voer c-Fos-kleuring uit zoals in punt 9.5 van dit protocol met behulp van een c-Fos primair antilichaam en een secundair antilichaam met een fluorescerend label dat verschilt van de nucleaire vlek.
- Tel het percentage cellen dat positief is voor zowel c-Fos als nucleaire kleuring in het gebied dat het doelwit is van een chemogenetische receptor.
- Analyseer het percentage c-Fos-positieve kernen in een groep muizen die chemogenetische receptoren tot expressie brengen en worden behandeld met een chemogenetische ligand of voertuigcontrole en in een groep wild-type muizen die worden behandeld met een chemogenetische ligand of voertuigcontrole.
Representative Results
De eerste stap van het uitvoeren van het ATAC-protocol is het richten van de FUS-BBBO op de gewenste hersengebieden. Volgens het beschreven protocol werd de hippocampus bijvoorbeeld aangevallen met FUS-BBBO en werden contrastmiddel en AAV9 met DREADDs in de muizen geïnjecteerd, gevolgd door een FLASH 3D MRI-sequentie die beelden van het muizenbrein verwerft. Een T1-signaalversterking werd bereikt in het hippocampusgebied (figuur 6) en in andere delen van de hersenen (figuur 7). Na enkele weken werden DREADDs uitgedrukt in het doelhersengebied. Hoewel veel DREADD's zijn gefuseerd met een fluorescerende reporter (bijv. mCherry), bleek het proces van perfusie en fixatie met formaldehyde de fluorescentie van deze eiwitten drastisch te verminderen. Immunostaining tegen mCherry of de DREADD leidde tot een betrouwbaardere detectie van de expressie (figuur 8) op basis van eerdere ervaringen. In eerdere experimenten vertoonde ~ 85% van de muizen expressie na FUS-BBBO7. Een eenvoudige test voor voldoende expressieniveaus van DREADDs is het testen van hun functionaliteit op cellulair niveau. Het kan bijvoorbeeld worden gedaan door een chemogenetische ligand of een zoutoplossingcontrole te geven, zoals CNO 19, deschloroclozapine28 of anderen29, en 2 uur te wachten voor een hartperfusie en fixatie. De hersensecties werden vervolgens co-immunogekleurd voor c-Fos-eiwit30, wat wijst op verhoogde activiteit van neuronen, en voor DREADD. Het experiment werd als succesvol beschouwd, als de plaats van de hersenen gericht op DREADDs een significant hoger aantal neuronale kernen vertoonde die c-Fos-positief zijn in de groep die een chemogenetisch ligand ontving in vergelijking met de groep die zoutoplossing7 ontving of vergeleken met een contralaterale site die niet werd onderworpen aan FUS-BBBO. Van belang is dat er een potentieel is voor sommige van deze liganden om neuronen niet-specifiek te activeren zonder expressie van DREADDs. Van CNO is bijvoorbeeld aangetoond dat het wordt gemetaboliseerd tot lage niveaus van clozapine bij muizen, die de BBB kruist en DREADDs met een hoge potentie activeert27. Er werd echter ook aangetoond dat het zich bindt aan niet-specifieke locaties. Zoals in elk experiment is het van cruciaal belang om alle juiste controles op te nemen in chemogenetische studies31. Een mogelijke controle is toediening van het chemogenetische ligand aan wildtype muizen, zonder procedures, om effecten van het medicijn alleen op de gewenste gedrags- of histologische test uit te sluiten. Een andere controle zou de opname van vier groepen kunnen zijn: DREADD + ligand, DREADD + voertuig, EGFP + ligand, EGFP + voertuig, die rekening houden met mogelijke effecten van zowel genafgifte met FUS-BBBO als de chemogenetische ligand.
Figuur 1: Het proces van MRI-geleide targeting van FUS in ATAC. (a) Muisplaatsing met oorbalken, een neuskegel en een platform dat in een MRI-scanner kan worden geplaatst. (b) Een 3D-geprinte gids (blauw) die zichtbaar is in MRI werd bevestigd aan de uiteinden van het oorbalkframe en vervolgens op zijn plaats bevestigd met een houder van een oppervlakte-MRI-spoel die vier klikbouten bevat (semi-transparant blauw). c) Weergave van de 3D-geprinte gids in sagittale MRI (linkerpaneel), met een onderkant van de virtuele weergave van een transducer uitgelijnd (gele halve cirkel) met de onderkant van de geleider. Het rechterpaneel toont het uiterlijk van de 3D-geprinte gids op MRI vanuit coronale weergave. De heldere cirkel is gemaakt van een polyjet ondersteuningsmateriaal dat een sterk MRI-contrast heeft. Het kruis was gevormd met plastic. Een gele cirkel vertegenwoordigt de locatie van de transducer die concentrisch was uitgelijnd met de geleider in een stereotaxisch frame. (d) Om hersenstructuren te targeten, werd een virtuele transducer in z-richting boven de muizen verplaatst om overeen te komen met de dikte van een ultrasone kegel / behuizing. In dit geval werd de transducer vanwege de dikte van het waterbad 8,2 mm boven de geleider verplaatst voor nauwkeurige targeting. Hersenstructuren werden geselecteerd met behulp van MRI-beeldvormingsgegevens en hun MRI-coördinaten werden vervolgens opgeschreven en ingevoerd in de stereotaxische machine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Interface van de gebruikte software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Proces van het matchen van MRI-coördinaatruimte met stereotaxisch instrument. (a) Drie gaten in een transducerhouder werden uitgelijnd met drie gaten in de MRI-geleider en drie conische richtbouten werden ingebracht zonder buiging aan de hele assemblage te veroorzaken. (b) Idealiter zouden alle drie de bouten in het midden van de gaten zitten. c) Als er een onnauwkeurigheid is in de uitlijning, zouden niet alle drie de bouten erin passen, bijvoorbeeld in het geval van een kleine, waarschijnlijk onmerkbare geeuw van 1°, zou er slechts één bout in passen, terwijl de tegenovergestelde bouten aan de MRI-geleider zouden vastzitten. Als alternatief kon er zichtbare flex van de hele assemblage zijn als bouten werden doorgedrukt. d) Verruimde weergave van de boutfitting. De bouten moeten concentrisch worden geplaatst voor de beste nauwkeurigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Snelle herverdeling van microbubbels in de spuit. (a) De spuit werd 5 s na het mengen gefotografeerd. b) Een minuut later was er een duidelijk zichtbare laag met een deel van het bellenconcentraat aan de bovenkant van 1 ml tuberculinespuit. Met name in dit voorbeeld werd een oplossing van microbubbels gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Proces van het plaatsen van het midden van een transducer over een midden van een MRI-gids. a) In de in dit document getoonde modellen is de rode drager ontworpen om 10,56 mm naar voren te bewegen van de positie in figuur 3b naar de hier afgebeelde positie. (b) De blauwe MRI-gids werd vóór de ultrasoonapparaat verwijderd en een ultrasone gel werd aangebracht tussen de muis en de transducer (oranje) om ultrasone passage te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: MRI-visualisatie van de BBB-opening. a) Axiale weergave van de BBB-opening. Helderder gebied aangeduid met een pijlpunt toont extravasatie van een MRI T1-contrastmiddel . (b) Coronale weergave van de dorsale hippocampus en de cortex boven de hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). c) Coronale weergave van de centrale hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbeeld van targeting van 4 hersensites met behulp van het driebouts targetingsysteem dat in dit artikel wordt beschreven. Gebieden met pijlpunten toonden BBB geopende plaatsen met diffusie van een MRI-contrastmiddel. De vier sites werden achtereenvolgens getarget, met ~ 150 s tussen elke BBB-opening, van onder naar boven. De foto is genomen binnen 2 minuten na de laatste BBB opening. Schaalbalk is 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Detectie van DREADD-expressie. a) Immunokleuring voor de fluorofoor die aan DREADD's is bevestigd, in dit geval was mCherry in sommige onderzoeken een betrouwbare detectiemethode. b) In een ander representatief gedeelte met DREADD's gericht op de hippocampus onder dezelfde omstandigheden als onder a), produceerde de fluorescentie van mCherry op zichzelf een sterke achtergrond en een relatief zwak signaal. c) Als negatieve controle werd een muis gebruikt die een systemische injectie met AAV kreeg, maar geen FUS-BBBO onderging. Er kan geen significante expressie worden gevonden door mCherry immunostaining. Schaalstaven zijn 500 mm. (Gegevens in a, c aangepast van7 met machtigingen, Copyright 2020 Nature-Springer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
ATAC vereist een succesvolle implementatie van verschillende technieken voor succesvolle neuromodulatie van specifieke neurale circuits, waaronder nauwkeurige MRI-geleide targeting, FUS-BBBO en histologische evaluatie van genexpressie. 3D-printbare componenten zijn ontwikkeld om het richten op kleine hersenstructuren te vereenvoudigen met beeldgestuurde FUS-BBBO.
MRI-geleide gerichte echografie (MRIgFUS) toediening brengt een aantal uitdagingen met zich mee. Ten eerste heeft een typische MRI-spoel een beperkte ruimte die is ontworpen om alleen een monster te huisvesten en niet de echografiehardware. De grotere boringen van MRI's verhogen de kosten van apparatuur en verminderen de beeldkwaliteit, omdat het signaal gerelateerd is aan de vulfactor van een spoel32. Bijgevolg zal elke FUS-hardware die op de bovenkant van een dierbeeld in MRI wordt geplaatst, de beeldkwaliteit in gevaar brengen. Ten tweede is het ontwerpen van MRI-compatibele apparaten moeilijk en duur. MRI-compatibele materialen moeten diamagnetisch zijn, een lage neiging hebben om wervelstromen te creëren tijdens radiofrequente bestraling en een lage magnetische gevoeligheid hebben in hoge magnetische velden. In elk geleidend materiaal zal de creatie van wervelstromen of de magnetische gevoeligheid ervan ook de beeldkwaliteit negatief beïnvloeden. Ten slotte hebben de beschikbare MRI-compatibele materialen een lagere moduli en duurzaamheid van Young dan de metalen die doorgaans worden gebruikt bij de productie van nauwkeurige richtmachines, zoals stereotaxische frames. De motoren die worden gebruikt voor positieaanpassingen moeten MRI-compatibel zijn en vanwege hun grootte buiten de MRI-boring worden geplaatst. Deze motoren moeten op afstand worden aangesloten op de transducer in een MRI-boring met behulp van MRI-compatibele materialen. Problemen met plastic kromtrekken, gebrek aan voldoende ruimte in de boring om componenten van robuuste grootte te implementeren en onvoldoende ruimte voor het veranderen van richtposities in de hele hersenen hebben de targetingnauwkeurigheid in eerder werk beïnvloed.
Om deze problemen op te lossen, werd besloten om beeldvorming uit te voeren in MRI en FUS-BBBO toediening buiten de scanner. Om MRI-begeleiding mogelijk te maken, werden muizen in een 3D-geprinte beperking geplaatst met een MRI-zichtbare richtgids die kon worden gebruikt om de hersenstructuren van de muis te lokaliseren, zowel in de MRI als in de stereotaxcoördinatenruimte. Omdat zowel de muizenschedel als de richtgeleider stevig zijn bevestigd aan oorbalkhouders (figuur 1a,b), kan een richtgids worden gebruikt om ruimtelijke coördinaten binnen het MRI-beeld te correleren en de stereotaxische instrumenten nul te zetten. Het beveiligingssysteem heeft geen bewegende delen en bevat geen transducer, waardoor we het zowel robuust als voldoende klein konden maken om in een MRI te passen en signaalinterferentie van de elektronica van de transducer konden verwijderen. De ruimte in de richtgeleider is uitgehold omdat de 3D-geprinte ondersteuning voor sommige materialen zichtbaar is in MRI (figuur 1c). Er werden gaten in de assemblage aangebracht om stereotaxiskalibratie mogelijk te maken (figuur 3). De ultrasone transducer werd bevestigd aan een elektrodehouder van een stereotaxis en de targeting werd uitgevoerd zoals beschreven in rubriek 4 (figuur 1d). De transducer moet over de lengte worden ondersteund door de behuizing van oorbalken, waardoor elke afwijking van het vlakke vlak wordt voorkomen. De targeting in de dorso-ventrale richting kan worden bereikt met behulp van faseverschuivingen in een ringvormige array.
De praktische richtprecisie wordt bepaald door ultrasone scherpstelling en schedelverzwakking. De FUS-BBBO-procedure is in detail beschreven voor ratten 11 en is geïmplementeerd in een aantal andere modelorganismen23,33,34 en bij mensen 16,17. De relatie tussen ultrasone focusgrootte omgekeerd evenredig met frequentie, waarbij hogere frequenties kunnen resulteren in een nauwkeurigere afgifte. De verzwakking van de schedel neemt echter toe met frequenties35, wat kan leiden tot schedelverwarming en schade aan de corticale gebieden. De exacte targetingstrategie hangt af van de hersensite. De plaatsen waar een halve maximale druk over de volledige breedte in het hersenweefsel past, zorgen voor een voorspelbare en veilige BBB-opening in veel hersenstructuren zoals het striatum, de middenhersenen en de hippocampus. Regio's in de buurt van de basis van de hersenen vormen een specifieke uitdaging bij muizen. Muishersenen meten ongeveer 8-10 mm in dorso-ventrale richting, wat vergelijkbaar is met de volledige breedte halve maximale grootte van veel in de handel verkrijgbare transducers. Bijgevolg kan het richten op de bodem van de schedel leiden tot ultrasone reflectie van de botten en lucht die aanwezig zijn in gehoorgangen, mond of luchtpijp, wat kan leiden tot onvoorspelbare patronen van hoge en lage druk36. Sommige van deze drukken kunnen een traagheidscavitatiedrempel overschrijden waarvan is aangetoond dat deze bloedingen en weefselbeschadiging veroorzaakt37. Om gebieden te targeten die zich in de buurt van de schedelbasis bevinden, kan het de voorkeur hebben om intersectionele ATAC7 te gebruiken, waarbij intersectionele genetica38 wordt gebruikt om genexpressie te beperken tot een kleiner gebied dan het gebied dat is gericht met FUS-bundel. In het gepubliceerde voorbeeld van intersectionele ATAC is een transgeen dier dat een genbewerkingsenzym (Cre38) tot expressie brengt in dopaminerge cellen het doelwit geweest van echografie in de subsectie van het gebied dat dopaminerge cellen bevat. Ten slotte kunnen de corticale gebieden worden gericht met FUS, maar de diffractie en reflectie van echografie kan optreden en leiden tot ongelijke drukprofielen. Dit protocol heeft geen betrekking op de targeting van corticale gebieden, omdat dit sterk afhankelijk zal zijn van de gebruikte soorten; er is echter enige gerichtheid van de cortex boven hippocampus 7 (bijv. Figuur 7) waargenomen, wat aangeeft dat dit, althans bij muizen, mogelijk is.
De keuze van een chemogenetische activator en dosering zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften. Een aantal studies, waaronder een van de studies van de auteurs7, toonden geen significante niet-specifieke respons39,40, terwijl hogere doses (bijv. 10 mg / kg) bijwerkingen kunnen veroorzaken, althans in sommige gevallen41. Zoals bij alle gedragsexperimenten zijn goede controles31 echter essentieel vanwege mogelijke off-gerichte activiteit van CNO en zijn metabolieten42. Dergelijke controles kunnen bestaan uit toediening van CNO- en zoutoplossingscontroles aan dieren die DREADDs tot expressie brengen en toediening van CNO aan dieren van het wilde type of in sommige specifieke gevallen een vergelijking van ipsi- en contralaterale plaatsen van de hersenen die respectievelijk wel en geen chemogenetische receptoren tot expressie brengen. Bovendien onthulde recent onderzoek een aantal nieuwe DREADD-agonisten met verbeterde specificiteit28,29,43. Andere chemogenetische receptoren 5,25,44 kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de ATAC-procedure.
Histologische evaluatie van genexpressie is post-mortem noodzakelijk voor elk dier. Een klein deel van de dieren vertoont een slechte genexpressie na FUS-BBBO7. Bovendien is het noodzakelijk om de ruimtelijke nauwkeurigheid en specificiteit van genexpressie aan te tonen, omdat mis-targeting mogelijk is. Van belang is dat sommige AAV's retrograde of anterograde traceringsvermogen45 kunnen vertonen en transfectie kunnen veroorzaken ver van de site die met echografie is gericht, ondanks nauwkeurige ultrasone targeting. Als de tot expressie gebrachte chemogenetische receptor is gefuseerd met of co-expressie brengt met een fluorofoor, kan beeldvorming van de fluorofoor in weefselsecties voldoende zijn om de lokalisatie en intensiteit van expressie te evalueren. Veel fluorescerende eiwitten worden echter beschadigd door het weefselfixatieproces en immunostaining voor mCherry-eiwit dat vaak wordt gebruikt met DREADDs leverde een beter signaal op in eerdere studies7. Ten slotte, vanwege de dichtheid van neuronen in bepaalde delen van de hersenen (bijv. Granulaire cellaag in hippocampus), kan het gebruik van nucleair gelokaliseerde fluoroforen uitgedrukt onder IRES, in tegenstelling tot fusies, om celtellingen uit te voeren, gunstig zijn, omdat kernen gemakkelijk kunnen worden gesegmenteerd en tegengekleurd met nucleaire vlekken, zoals DAPI of TO-PRO-3. Om neuromodulatie door c-Fos-kleuring te evalueren, is het uitvoeren van nucleaire tegenkleuring en het tellen van c-Fos-positieve kernen, in plaats van een fluorescentiesignaal, noodzakelijk. In sommige gevallen kan cellulair puin fluorescentie vertonen en de metingen van positieve cellen verstoren.
Beperkingen van het geneesmiddel en de genafgifte met FUS-BBBO omvatten een lagere resolutie dan toediening met invasieve intracraniële injecties en de behoefte aan grotere hoeveelheden geïnjecteerde geneesmiddelen of virale vectoren. Bovendien, terwijl een directe injectie in de hersenen resulteert in exclusieve toediening aan een geïnjecteerde plaats, gebruikt FUS-BBBO een intraveneuze route die resulteert in mogelijke levering aan perifere weefsels. Beperkingen van het gebruik van chemogenetica voor neuromodulatie omvatten een langzame tijdschaal, die ontoereikend kan zijn voor sommige gedragsprotocollen die snelle veranderingen in de intensiteit van neuromodulatie vereisen.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Verschillende 3D-geprinte componenten zijn oorspronkelijk ontworpen door Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrijk). Auteur bedankt John Heath (Caltech) en Margaret Swift (Caltech) voor technische hulp bij het voorbereiden van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
