Summary
Detta protokoll beskriver steg som är nödvändiga för genleveransen genom fokuserad öppning av blod-hjärnbarriären (BBB) med ultraljud, utvärdering av det resulterande genuttrycket och mätning av neuromoduleringsaktivitet hos kemogenetiska receptorer genom histologiska tester.
Abstract
Akustiskt riktad kemogenetik (ATAC) möjliggör icke-invasiv kontroll av specifika neurala kretsar. ATAC uppnår sådan kontroll genom en kombination av fokuserat ultraljud (FUS) inducerad blod-hjärnbarriäröppning (FUS-BBBO), genleverans med adenoassocierade virala (AAV) vektorer och aktivering av cellulär signalering med konstruerade, kemogenetiska proteinreceptorer och deras besläktade ligander. Med ATAC är det möjligt att transducera både stora och små hjärnregioner med millimeterprecision med hjälp av en enda icke-invasiv ultraljudsapplikation. Denna transduktion kan senare möjliggöra en långsiktig, icke-invasiv, enhetsfri neuromodulering hos fritt rörliga djur med hjälp av ett läkemedel. Eftersom FUS-BBBO, AAV och kemogenetik har använts på flera djur bör ATAC också vara skalbart för användning i andra djurarter. Denna artikel bygger vidare på ett tidigare publicerat protokoll och beskriver hur man kan optimera genleveransen med FUS-BBBO till små hjärnregioner med MRI-vägledning men utan behov av en komplicerad MRI-kompatibel FUS-enhet. Protokollet beskriver också utformningen av musinriktnings- och fasthållningskomponenter som kan 3D-printas av vilket laboratorium som helst och enkelt kan modifieras för olika arter eller anpassad utrustning. För att underlätta reproducerbarheten beskriver protokollet i detalj hur mikrobubblor, AAV och venpunktion användes i ATAC-utvecklingen. Slutligen visas ett exempel på data för att vägleda de preliminära undersökningarna av studier som använder ATAC.
Introduction
Användning av kretsspecifika neuromodulationstekniker, såsom optogenetik1,2 och kemogenetik 3,4,5, har ökat vår förståelse av psykiatriska tillstånd som neuronala kretsstörningar. Neuronala kretsar är svåra att studera och ännu svårare att kontrollera vid behandling av hjärnsjukdomar eftersom de vanligtvis definieras av specifika celltyper, hjärnregioner, molekylära signalvägar och tidpunkt för aktivering. Idealet för både forskning och kliniska tillämpningar är att sådan kontroll utövas icke-invasivt, men att uppnå både exakt och icke-invasiv neuromodulering är en utmaning. Till exempel, medan neuroaktiva läkemedel kan nå hjärnan icke-invasivt, saknar de rumslig specificitet genom att verka i hela hjärnan. Å andra sidan kan elektrisk djup hjärnstimulering kontrollera specifika hjärnregioner men har svårt att kontrollera specifika celltyper och kräver operation och placeringav enheten 6.
Akustiskt riktad kemogenetik7 (ATAC) ger neuromodulering med rumslig, celltyps- och tidsspecificitet. Den kombinerar tre tekniker: fokuserad ultraljudsinducerad blod-hjärnbarriäröppning (FUS-BBBO) för rumslig inriktning, användning av adenoassocierade virala vektorer (AAV) för att icke-invasivt leverera gener under kontroll av celltypsspecifika promotorer och konstruerade kemogenetiska receptorer för att modulera transfekterade neurala kretsar selektivt via läkemedelsadministrering. FUS är en FDA-godkänd teknik som drar nytta av ultraljudets förmåga att fokusera djupt inne i vävnader, inklusive den mänskliga hjärnan, med millimeter rumslig precision. Vid hög effekt används FUS för icke-invasiv riktad ablation, inklusive en FDA-godkänd behandling för essentiell tremor8. FUS-BBBO kombinerar lågintensivt ultraljud med systemiskt administrerade mikrobubblor, som oscillerar i blodkärlen vid ultraljudsfokus, vilket resulterar i lokaliserad, tillfällig (6-24 timmar) och reversibel öppning av BBB9. Denna öppning möjliggör leverans av proteiner 9,10, små molekyler11 och virala vektorer 7,12,13,14 till hjärnan utan betydande vävnadsskador hos gnagare 10 och icke-mänskliga primater 15. Kliniska prövningar pågår för FUS-BBBO16,17, vilket indikerar möjliga terapeutiska tillämpningar av denna teknik.
Viral genleverans med hjälp av AAV avancerar också snabbt till klinisk användning för CNS-sjukdomar, med de senaste FDA- och EU-godkännandena som viktiga milstolpar. Slutligen används kemogenetiska receptorer18, såsom designerreceptorer som aktiveras uteslutande av designerdroger (DREADDs), i stor utsträckning av neuroforskare för att ge farmakologisk kontroll över neuronal excitation hos transgena eller transfekterade djur19,20. DREADDs är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som har modifierats genetiskt för att svara på syntetiska kemogenetiska molekyler snarare än endogena ligander, så att systemisk administrering av dessa ligander ökar eller minskar excitabiliteten hos DREADD-uttryckande neuroner. När dessa tre tekniker kombineras till ATAC kan de användas för icke-invasiv modulering av utvalda neurala kretsar med rumslig, celltyp och tidsmässig precision.
Här utökar och uppdaterar vi ett tidigare publicerat protokoll för FUS-BBBO11 genom att inkludera metodik för noggrann målsökning av hjärnregioner med FUS-BBBO i möss med hjälp av enkel 3D-printad målsökningsutrustning. Vi visar också en tillämpning av FUS-BBBO på ATAC. Vi visar steg som är nödvändiga för leverans av AAVs som bär kemogenetiska receptorer, och utvärdering av genuttryck och neuromodulering genom histologi. Denna teknik är särskilt användbar för att rikta in sig på stora eller flera hjärnregioner för genuttryck eller neuromodulering. Till exempel kan ett stort område av en cortex enkelt transduceras med FUS-BBBO och moduleras med hjälp av kemogenetik. Genleverans med en alternativ teknik, intrakraniella injektioner, skulle dock kräva ett stort antal invasiva injektioner och kraniotomier. FUS-BBBO och dess tillämpning, ATAC, kan skalas till djur av olika storlekar, där hjärnregionerna är större och svårare att rikta in sig på invasivt.
Protocol
Alla experiment utfördes enligt ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid California Institute of Technology, där data ursprungligen erhölls av J.O.S.
1. Design och 3D-printing av djursele och bildstyrningshårdvara
- Använd filerna från Szablowski-labbets webbplats på: https://www.szablowskilab.org/downloads för 3D-utskrift av komponenterna.
- Se till att utskriftsmaterialet har låg känslighet vid MR men har ett MR-synligt stöd. Se detaljerna för material som används i avsnittet om material och reagenser.
- Ta hänsyn till materialnedbrytningen vid flera användningsområden genom att testa materialet upprepade gånger och observera de slitageställen som bör förstärkas. Se till att de tryckta väggarna är minst 2 mm tjocka.
- Använd 3D-skrivare med hög precision för att förbättra målprecisionen.
- Motverka gravitationen och andra krafter för att undvika avvikelser från 3D-printade plastkomponenter genom att stödja komponenterna längs deras längd och öka tjockleken på de 3D-printade väggarna om någon böjning observeras.
- Ta hänsyn till precision i flera axlar inklusive främre/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral, samt girning, stigning och lutning.
- Testa noggrannheten i inriktningen genom att utföra FUS-BBBO och registrera avvikelsen från målpositionen.
- Om du använder motoriserade stereotaktiska system, utvärdera effekterna av dynamisk rörelse på materialets elasticitet genom att spela in FUS-BBBO-målsökningsproceduren på video och korrigera eventuella avvikelser genom att förtjocka de 3D-printade materialväggarna.
2. Beskrivning av ultraljudssystem
- Använd ett ultraljudssystem med en ringformad arraygivare med åtta element (diameter = 25 mm, naturlig brännpunkt = 20 mm; bländare (F) = 0,8)) och koppla höljet till huvudet med avgasad ultraljudsgel genom att applicera gel på det rakade mushuvudet.
OBS: Mittfrekvensen för en givare som användes i en tidigare studie7 var 1.5 MHz, pulslängden var 10 ms och pulsrepetitionsfrekvensen var 1 Hz över 120 s. Trycken kalibrerades med hjälp av optisk fiberhydrofon och hölls mellan 0,36-0,45 MPa. Antag 18 % akustisk dämpning genom skallen21 för 1,5 MHz och parietalbenet. De olika förhållanden som är lämpliga för en säker BBB-öppning och AAV-leverans har beskrivits på andra ställen i detalj 7,14,22.
3. Beredning av djur
- Bedöva en mus med isofluraninhalation vid 2 % med medicinsk luft. Kontrollera anestesidjupet genom att nypa i en nypa för att bekräfta bristande svar. Applicera sedan oftalmisk salva för att förhindra uttorkning av hornhinnan med en steril bomullspinne för engångsbruk för att förhindra korskontaminering av salvröret.
OBS: Typisk procedur för FUS-BBBO kan variera mellan 30 minuter och 2 timmar, och anestesi måste bibehållas under hela proceduren. - Efter att musen har sövts tvättas en ren kateter med hepariniserad koksaltlösning (10 E/ml).
OBS: En lämplig kateter för en mus på 25-35 g har en nål på 30 G och en PE10-slang. - Desinficera sedan mussvansen med 70 % etanolkudde. Placera svansvenskatetern i en lateral svansven och fäst den med ett vävnadslim. Observera ett återflöde av blod från svansvenen in i katetern för att bekräfta dess placering.
- Raka mushuvudet och använd sedan hårborttagningskräm efter att vävnadslimmet har torkat för att minska risken för att luftbubblor fastnar under ultraljudsgel under insonation.
- Placera musen i en 3D-printad MR-vagn, montera framtänderna på en bettstång och huvudet inuti en noskon (Figur 1a).
- Injicera upp till 10 μl lidokain subkutant på det ställe som kommer i kontakt med de trubbiga öronstavarna. Fäst sedan de trubbiga stängerna på skallen och tryck på ett säkert sätt, var noga med att inte trycka på luftstrupen eftersom det hindrar andningen. Observera andningen i 30 s för att bekräfta att djuret andas fritt med en hastighet av 1/s.
- Anslut inriktningsguiden till öronstängerna, kontrollera andningen som i steg 3.6 (Figur 1b) och fortsätt att övervaka andningen visuellt under hela proceduren varje minut. En andningsfrekvens förhöjd över 1/s är en av indikationerna på förlust av anestesi. Fortsätt att övervaka tånypresponsen var 5:e minut när möss inte är i MR-skannern eller om andningsfrekvensen är förhöjd över 1/s.
- Överför MR-vagnen till en MR-hållare och sedan in i hålet på en magnet.
OBS: Hårdvarans design är optimerad för en 72 mm spole inuti en 7T MRI. - Skaffa en MRT-sekvens för att lokalisera musen i skannern.
- Välj sekvensen 3D fast low angle shot (FLASH) för att samla in hela hjärnan, med hjälp av följande parametrar, enligt specifika instruktioner från instrumenttillverkaren. Ekotid: 3,9 ms, Repetitionstid: 15 ms, Excitationspulsvinkel: 15°, Matrisstorlek: 130 x 130 x 114, Upplösning: 350 x 200 x 200 μm per voxel, Medelvärden: 1, Förvärvstid: 3 min 42s
- Överför filer från MRT-systemet till en dator som styr FUS-systemet.
- Öppna bildsekvensen i programvaran för att utföra MRT-styrd inriktning, där bilden ska se ut som i figur 1c.
4. MRT-styrd inriktning
OBS: Med användning av specialdesignade inriktningsguider är det inte nödvändigt att placera ultraljudsgivaren i en MRT, och det är inte heller nödvändigt att snitta huden för att utföra inriktning genom att nollställa stereoskatt på bregma- och lambdalinjer. Följ stegen nedan för att utföra inriktningsprocessen.
- Placera vagnen i ett stereotiskt instrument. Fäst den på plats med ett metallblock med dubbelhäftande tejp och genom att trycka vagnen mot två stödstolpar på det stereotaktiska instrumentet.
- Överför MR-bilder till en dator med ett FUS-vägledningsprogram som körs genom att välja filer i Datahanteraren, högerklicka för att visa menyalternativ och välja "Överför omedelbart".
- Öppna FUS-vägledningsprogrammet och ladda bilden genom att klicka på "Öppna sekvens" och ladda alla filer i bildsekvensen.
- Formatera om bilden till tre axlar genom att högerklicka och "Formatera om".
- Lokalisera givaren till den cirkulära inriktningsguiden (Figur 1c) genom att högerklicka.
- I sagittal view, justera den vertikala positionen för en virtuell givare för att ta hänsyn till tjockleken på vattenbadet och givarhuset (i detta fall – 8.2 mm uppåt, figur 1d).
- Peka på det eller de områden som ska riktas in i banplaneraren och notera koordinaterna i ett kalkylblad (i det här fallet – mitthjärnan, som i figur 1d).
- Ställ in önskat måldjup (z-värde i elektronisk bana (figur 2) och notera koordinater i ett kalkylblad.
- Rikta in dig på var och en av punkterna genom att trycka på "Skicka bana" och "Kör" (Figur 2).
OBS: Detta görs när en mushållare placeras inuti motorerna. Samma målinriktning kan dock uppnås med hög noggrannhet på ett stereotiskt instrument. - För att korrelera koordinaterna för en MRT med den stereotaktiska ramen, placera den specialmonterade givaren över en målguide och översätt tills var och en av de tre målbultarna (figur 3, element A) kan gå igenom både givarhållaren (figur 3, element B) och inriktningsguiden (figur 3, element C). Kontrollera att bultarna inte är spända eller lutande.
- Flytta givaren 10.56 mm framåt i främre/bakre riktning tills den är placerad på samma plats där ett centrum av en målguide visas på en MRT.
- Bestäm avståndet från ett centrum av den virtuella givaren (Figur 3a, element A) till målområdet (Figur 3a, element B), och flytta givaren till dessa koordinater med hjälp av stereotaktisk ram.
- Fortsätt med beredningen av injektionslösningen.
5. Beredning av injektionslösning
OBS: Mikrobubbellösningarna är mycket känsliga för tryck. Följaktligen kan kraftig blandning eller snabb injektion genom tunna nålar kollapsa mikrobubblorna och minska effekten av BBB-öppningen. Dessutom är mikrobubblor lättare än vatten och kan flyta till toppen av en slang, kateter eller spruta (figur 4), t.ex. i en automatisk injektor. Det rekommenderas starkt att mikrobubbellösningen återblandas omedelbart före varje injektion.
- Dra upp 0,8 ml koksaltlösning med hjälp av en spruta i 1,5 ml slang.
- Använd en spruta, tillsätt 0,1 ml MRT-kontrastmedel i samma 1,5 ml rör och blanda.
- Bringa den icke-aktiverade mikrobubblan23,24-lösningen till rumstemperatur.
- Strax före insonationen, aktivera mikrobubblor i 45 s i en mikrobubbelaktiveringsanordning.
- Dra långsamt (över ~3 s) ut 0,1 ml mikrobubblor med en 1 ml tuberkulinspruta och 21 G nål från vätskedjupets mittdjup.
- Tillsätt 0,08 ml mikrobubblor i lösningen av kontrastmedel och koksaltlösning som beretts i steg 5.3. Blanda genom att knacka med handen i 15 s.
- Med den slutliga koncentrationen av AAVs på 0,5-2 x 10 10 viruspartiklar per gram kroppsvikt (VP/g), injicera lasten för leverans (i detta fall AAV9) genom30 G nål i svansvenskatetern, vid ATAC – AAVs som bär kemogenetiska receptorer, eller en negativ kontroll, såsom AAVs som bär GFP under samma promotor.
- Blanda mikrobubblorna för hand i 15 s igen för att undvika flytning (Figur 4).
- Omedelbart därefter aspirera 200 μl av mikrobubbellösningen genom en spruta utan nål. Avsaknaden av en nål kommer att minska skjuvkrafterna på mikrobubblor.
- Vänd sprutan upp och ner och blanda genom att trycka kolven upp och ner.
- Fäst 30 G-nålen och tryck långsamt ut mikrobubblorna tills droppar syns i änden av nålen, medan de fortfarande är uppochnedvända.
6. Insonationsförfarande
- Ställ in parametrarna för insonation: 10 ms pulslängd, 120 upprepningar, varje s och 0,30-0,45 MPa tryck vid skallen.
- Ta bort inriktningsguiden och applicera avgasad ultraljudsgel på mushuvudet, se till att det inte bildas några bubblor.
- Sänk givaren och placera den direkt på platt öronstångshållaren och slå in koordinaterna i de stereotaktiska instrumenten (Figur 5).
- Injicera AAV-lösningen (0,5-2 x 1010 VP/g).
- Blanda mikrobubblor och MR-kontrastmedelslösningen i 15 sekunder och injicera 80 μl per 30 g mus.
- Applicera omedelbart ultraljud i 120 s genom att trycka på "Skicka" och "Kör".
- Om mer än en plats är inriktad flyttar du givaren till den platsen och justerar djupinriktningen efter siffrorna i kalkylbladet från steg 4.7-4.9. Upprepa sedan steg 6.5-6.6 för varje insonerat ställe.
7. MRT-utvärdering av BBB-öppning
OBS: MRT-utvärderingen av BBB-öppningen har beskrivits i detalj på annan plats11. Platsen för BBB-öppningen kan visualiseras som ljusare områden hos möss som fått en injektion av ett T1-viktat Gd-kontrastmedel.
- Efter ultraljudsappliceringen, spela in en MRT-sekvens som i steg 3.10.
- Ta bort musen från MR-skannern och placera den i en uppvakningsbur för att möjliggöra återhämtning från anestesi. Övervaka mössen dagligen för tecken på lidande, viktminskning eller andra humana slutpunkter. Rådgör med veterinärpersonal och institutionens IACUC-riktlinjer för att fortsätta med någon behandling om oväntade biverkningar skulle inträffa.
8. DREADD-stimulering med en kemogenetisk ligand
- Välj en kemogenetisk receptor. För DREADDs, välj hM3Dq-receptorn för neuronal aktivering via Gq-kopplade vägar19, hM4Di-receptorn för hämning av neuronal aktivitet genom Gi/o-kopplade vägar20, eller KORD-receptorn för aktivering av neuroner via Gs-kopplade vägar med Salvinorin-B-ligand25.
- Lös upp klozapin-n-oxid (CNO) i steril koksaltlösning i en koncentration av 1 mg/ml. Förvara den aliciterade CNO:n vid -20 °C.
- Administrera CNO 19, eller annan kemogenetisk ligand26,27,28, intraperitonealt vid koncentrationer mellan 0,3 –10 mg/kg.
- Om effekterna av CNO på beteendet ska registreras, börja registrera beteendeaktiviteten inom 15-45 minuter efter läkemedelsadministreringen för att uppnå maximal aktivering av DREADDs19.
- Om analys av neuronal aktivering önskas, använd möss för histologisk utvärdering efter 60-120 minuter efter injektion.
- Fortsätt med eutanasi genom hjärtperfusion (se avsnitt 9).
9. Histologisk utvärdering av genuttryck och kemogenetisk aktivering
OBS: När det experimentella effektmåttet (t.ex. slutet av beteendestudien, den tid som krävs för genuttryck) har uppnåtts är det viktigt att bekräfta platsen och närvaron av genuttrycket.
- Efter aktivering med en kemogenetisk ligand, utför hjärtperfusion för att bevara vävnader.
- Bedöva musen med Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) blandning i steril koksaltlösning genom en IP-injektion. Bekräfta bedövningen med ett nyp i tårna och se till att andningsfrekvensen har sänkts till cirka 1/s. Ge termiskt stöd genom värmedynan tills avlivningen bekräftas.
- Bered 10 % neutralt buffrat formalin (NBF) och PBS med 10 enheter heparin per ml.
OBS: Lösningarna ska vara vid 4 °C. - Häll varje buffert i separata 50 ml rör och anslut och fyll en peristaltisk pump ansluten till en 25 G fjärilskateter med PBS/heparinlösning.
- Fäst lemmarna på en absorberande blå dyna med tejp och se till att djuret placeras i ryggläge på dynan. Desinficera pälsen för att undvika korskontaminering av perifera organ om de skulle behöva samlas in.
- Öppna bukhålan med ett tvärsnitt och exponera diafragman.
- Öppna bröstkorgen genom två snitt av kirurgisk sax längs den främre/bakre axeln.
- Exponera hjärtat och placera nålen i en vänster kammare (höger sida av hjärtat sett på rygg) och placera den i fjärilskatetern i steg 9.1.3.
- Gör ett litet snitt i höger kammare för att tillåta blodflöde.
- Slå på den peristaltiska pumpen för att börja spola ut blodet med PBS/heparin.
OBS: Om detta steg inte utförs på ett adekvat sätt kommer blodet att koagulera under fixering med formalin och förhindra lämplig perfusion. - När allt blod har spolats ut och klar PBS börjar komma ut ur höger kammare, byt inloppet till en peristaltisk pump till en NBF-lösning och börja perfusionera för 25 ml per mus.
- Extrahera hjärnan, placera i minst 4 ml NBF och post-fix i 24 timmar.
- Snitta hjärnan med koronasnitt på en vibratom med 50 μm snitttjocklek.
- Placera varje sektion i en brunn med 24 brunnar som lagrar sektionerna i hela hjärnan.
- Utvärdera uttrycket av de kemogenetiska receptorerna som är sammansmälta med fluorescerande proteiner (t.ex. mCherry eller mCitrine) under ett fluorescerande mikroskop för att identifiera de sektioner som visar uttryck för att bekräfta platsen. Uttrycket kommer sannolikt att vara svagt.
- Utför immunfärgning mot fluoroforen med hjälp av följande protokoll:
- Placera 3 sektioner i 0,5 ml lösning som innehåller 10 % serum av en värd för en sekundär antikropp och inkubera i 30 minuter.
- Överför snitten till en lösning av en primär antikropp vid spädning 1:250 – 1:1 000, med 1:500 som utgångspunkt.
- Inkubera snitten med primär antikropp över natten vid 4 °C i en mikroplatta förseglad med en paraffinfilm.
- Tvätta sektionerna med PBS, 3 gånger i 5 min åt gången.
- Tillsätt 0,5 ml av den sekundära antikroppslösningen per brunn i 10 % serum.
- Inkubera i 4 timmar i rumstemperatur.
- Tvätta sektionerna med PBS, 3 gånger i 5 min åt gången.
- Montera på objektglas med ett vattenhaltigt monteringsmedium som innehåller en kärnfärgning (t.ex. DAPI).
- Utvärdera lokalisering och spridning med hjälp av ett konfokalmikroskop genom att utföra en kakelskanning av en hel sektion.
- Utvärdera uttrycksintensiteten genom att mäta fluorescenspixelintensiteten i riktade hjärnregioner och jämföra med en intrakraniellt injicerad kontroll.
- Alternativt kan du utvärdera procentandelen positiva neuroner genom att räkna celler som färgats mot kemogenetiska receptorer, jämfört med DAPI-positiva celler eller cellspecifika markörer.
- Utvärdera vävnadsskadan genom att utföra hematoxylinfärgning på 50 μm snitt och avbildning för förlust av celler, ansamling av cellrester och andra tecken på grov skada.
- För att utvärdera specificiteten av cell-targeting, utför dubbel immunfärgning enligt beskrivningen nedan för den kemogenetiska receptorn och en cellspecifik markör. Utför sedan cellpositiva räkningar som i steg 9.8.
- Placera 3 sektioner i 0,5 ml av en lösning som innehåller 10 % serum av en värd för en sekundär antikropp och inkubera i 30 minuter.
- Överför snitten till en lösning av en primär antikropp mot en fluorescerande markör av en kemogenetisk receptor vid 1:250 – 1:1 000 utspädning, med 1:500 som utgångspunkt. Lägg till en andra primär antikropp från en annan värdart som är riktad mot en cellspecifik markör av intresse (t.ex. CamkIIa).
- Inkubera snitten med primär antikropp över natten vid 4 °C i en mikroplatta förseglad med paraffinfilm.
- Tvätta sektionerna med PBS, 3 gånger i 5 min åt gången.
- Tillsätt 0,5 ml sekundär antikroppslösning per brunn i 10 % serum av värdarterna för båda sekundära antikropparna.
OBS: Varje antikropp ska ha en distinkt fluorofor och ska vara reaktiv mot primära antikroppar i steg 9.10.2. - Inkubera i 4 timmar i rumstemperatur.
- Tvätta sektionerna med PBS, 3 gånger i 5 min åt gången.
- Montera på objektglas och fixera med ett vattenhaltigt monteringsmedium som innehåller en kärnfärg.
10. Utvärdera neuronal aktivering med immunfärgning för c-Fos
- Utför c-Fos-färgning enligt punkt 9.5 i detta protokoll med en primär c-Fos-antikropp och en sekundär antikropp med en fluorescerande etikett som skiljer sig från kärnfärgningen.
- Räkna procentandelen celler som är positiva för både c-Fos och kärnfärgning i det område som en kemogenetisk receptor riktar in sig på.
- Analysera andelen c-Fos-positiva kärnor i en grupp möss som uttrycker kemogenetiska receptorer och som behandlas med en kemogenetisk ligand eller vehikelkontroll och i en grupp vildtypsmöss som behandlas med en kemogenetisk ligand eller vehikelkontroll.
Representative Results
Det första steget i att utföra ATAC-protokollet är att rikta FUS-BBBO till de önskade hjärnregionerna. Till exempel, enligt det beskrivna protokollet, riktades hippocampus mot FUS-BBBO, och kontrastmedel och AAV9-bärande DREADDs injicerades i mössen, följt av en FLASH 3D MRI-sekvens som tar bilder av mushjärnan. En förstärkning av T1-signalen uppnåddes i hippocampusregionen (Figur 6) och i andra delar av hjärnan (Figur 7). Efter flera veckor uttrycktes DREADDs i målhjärnregionen. Medan många DREADDs är sammansmälta med en fluorescerande reporter (t.ex. mCherry), visade sig perfusionsprocessen och fixering med formaldehyd drastiskt minska fluorescensen hos dessa proteiner. Immunfärgning mot mCherry eller DREADD ledde till en mer tillförlitlig detektion av uttrycket (Figur 8) baserat på tidigare erfarenheter. I tidigare experiment visade ~85 % av mössen uttryck efter FUS-BBBO7. Ett enkelt test för tillräckliga nivåer av uttryck av DREADDs är att testa deras funktionalitet på cellulär nivå. Det kan till exempel göras genom att tillhandahålla en kemogenetisk ligand eller en saltlösningskontroll, såsom CNO 19, desklorklozapin28 eller andra 29, och vänta 2 timmar innan en hjärtperfusion och fixering. Hjärnsnitten var sedan co-immunfärgade för c-Fos protein30, vilket indikerar ökad aktivitet hos nervceller, och för DREADD. Experimentet ansågs vara framgångsrikt om den del av hjärnan som var föremål för DREADDs visade signifikant högre antal neuronala kärnor som är c-Fos-positiva i gruppen som fick en kemogenetisk ligand jämfört med gruppen som fick saltlösning7 eller jämfört med en kontralateral plats som inte utsattes för FUS-BBBO. Värt att notera är att det finns en potential för vissa av dessa ligander att aktivera neuroner icke-specifikt utan uttryck av DREADDs. Till exempel har CNO visat sig metaboliseras till låga nivåer av klozapin hos möss, som korsar BBB och aktiverar DREADDs med hög potens27. Men det visade sig också binda till icke-specifika platser. Som i alla experiment är det viktigt att inkludera alla korrekta kontroller i kemogenetiska studier31. En möjlig kontroll är administrering av den kemogenetiska liganden till vildtypsmöss, utan procedurer, för att utesluta effekter av läkemedlet ensamt på den önskade beteendemässiga eller histologiska analysen. En annan kontroll skulle kunna vara inkludering av fyra grupper: DREADD + ligand, DREADD + vehikel, EGFP + ligand, EGFP + vehikel, som kommer att ta hänsyn till eventuella effekter av både genleverans med FUS-BBBO och den kemogenetiska liganden.
Figur 1: Processen för MRT-styrd målsökning av FUS i ATAC. a) Musplacering med öronspärrar, en noskon och en plattform som kan monteras inuti en MR-skanner. (b) En 3D-printad guide (blå) som är synlig i MRT fästes i ändarna av öronbågens ram och säkrades sedan på plats med en hållare av en yt-MRT-spole som innehåller fyra snäppbultar (halvtransparent blå). (c) Utseende av den 3D-printade guiden i sagittal MRT (vänster panel), med en botten av den virtuella representationen av en givare i linje (gul halvcirkel) med botten av guiden. Den högra panelen visar utseendet på den 3D-printade guiden på MR från koronavy. Den ljusa cirkeln tillverkades av ett polyjet-stödmaterial som har en stark MR-kontrast. Korset formades av plast. En gul cirkel representerar givarens placering som var i linje koncentriskt med styrningen inuti en stereotaktisk ram. (d) För att rikta in sig på hjärnstrukturer flyttades en virtuell givare i z-riktning ovanför mössen för att matcha tjockleken på en ultraljudskon/hölje. I det här fallet, på grund av vattenbadets tjocklek, flyttades givaren 8,2 mm ovanför guiden för exakt inriktning. Hjärnstrukturerna valdes ut med hjälp av MRI-bilddata, och deras MRI-koordinater skrevs sedan ner och matades in i den stereotaktiska maskinen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Gränssnitt för den programvara som används. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Process för matchning av MRT-koordinatrummet till stereotaktiskt instrument. (a) Tre hål i en givarhållare var i linje med tre hål i MRT-guiden, och tre koniska målbultar sattes in utan att orsaka böjning av hela enheten. (b) Helst skulle alla tre bultarna sitta i mitten av hålen. (c) Om det finns någon oprecision i inriktningen skulle inte alla tre bultarna passa in, t.ex. vid liten, sannolikt omärklig gir på 1°, skulle endast en bult passa in medan de motsatta bultarna skulle sitta fast vid MRT-guiden. Alternativt kunde det finnas synlig flex i hela enheten när bultar pressades igenom. (d) Förstorad vy av bultmontering. Bultarna bör placeras koncentriskt för bästa noggrannhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Snabb omfördelning av mikrobubblor i sprutan. (a) Sprutan fotograferades 5 sekunder efter blandning. b) En minut senare syntes ett tydligt skikt som visade en del av bubbelkoncentratet nära toppen av en 1 ml tuberkulinspruta. I det här exemplet användes särskilt en lösning av mikrobubblor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Process för att placera mitten av en givare över ett centrum av en MRT-guide. (a) I de modeller som visas i detta dokument har den röda bäraren konstruerats för att röra sig 10,56 mm framåt från den position som visas i figur 3b till en position som visas här. (b) Den blå MRT-guiden togs bort före ultraljudsbehandling, och en ultraljudsgel applicerades mellan musen och givaren (orange) för att säkerställa ultraljudspassage. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: MRT-visualisering av BBB-öppningen. a) Axiell bild av BBB-öppningen. Ett ljusare område med en pilspets visar extravasering av ett MRT T1-kontrastmedel . (b) Koronabild av dorsala hippocampus och cortex ovanför hippocampus riktad med FUS-BBBO (pilspetsar). (c) Koronabild av den centrala hippocampus riktad med FUS-BBBO (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Exempel på inriktning på 4 hjärnställen med hjälp av det trebultade målsökningssystemet som beskrivs i det här dokumentet. Områden med pilspetsar visade att BBB öppnade platser med diffusion av ett MRT-kontrastmedel. De fyra platserna riktades in sig på varandra i följd, med ~150 s mellan varje BBB-öppning, från botten till toppen. Bilden är tagen inom 2 min efter den sista BBB-öppningen. Skalstrecket är 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 8: Identifiering av DREADD-uttryck. a) Immunfärgning av fluoroforen på dreadd, i detta fall mCherry, var en tillförlitlig detektionsmetod i vissa studier. (b) I ett annat representativt avsnitt med DREADDs riktade mot hippocampus med samma betingelser som i (a), gav fluorescensen av mCherry i sig stark bakgrund och relativt svag signal. c) Som en negativ kontroll användes en mus som fick systemisk injektion av AAV, men som inte genomgick FUS-BBBO. Inget signifikant uttryck kan hittas genom mCherry immunfärgning. Skalstrecken är 500 mm. (Data i a, c anpassad från7 med tillstånd, Copyright 2020 Nature-Springer). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
ATAC kräver framgångsrik implementering av flera tekniker för framgångsrik neuromodulering av specifika neurala kretsar, inklusive noggrann MRI-styrd målinriktning, FUS-BBBO och histologisk utvärdering av genuttryck. 3D-printbara komponenter utvecklades för att förenkla målsökning av små hjärnstrukturer med bildstyrd FUS-BBBO.
Administration av MRI-styrt fokuserat ultraljud (MRIgFUS) innebär ett antal utmaningar. För det första har typisk MR-spole begränsat utrymme som är utformat för att endast rymma ett prov och inte ultraljudshårdvaran. De större borrningarna i MRI ökar kostnaden för utrustning och minskar bildkvaliteten, eftersom signalen är relaterad till fyllnadsfaktorn för en spole32. Följaktligen kommer all FUS-hårdvara som placeras ovanpå en djurbild i MRT att äventyra bildkvaliteten. För det andra är det svårt och dyrt att designa MRI-kompatibla enheter. MRT-kompatibla material måste vara diamagnetiska, ha låg benägenhet att skapa virvelströmmar under radiofrekvent bestrålning och ha låg magnetisk känslighet i höga magnetfält. I alla ledande material kommer skapandet av virvelströmmar eller dess magnetiska känslighet också att påverka bildkvaliteten negativt. Slutligen har de tillgängliga MRI-kompatibla materialen lägre Youngs moduli och hållbarhet än de metaller som vanligtvis används vid tillverkning av precisionsmålsökningsmaskiner, t.ex. stereotaktiska ramar. Motorerna som används för positionsjusteringar måste vara MR-kompatibla och placerade utanför MR-hålet på grund av sin storlek. Dessa motorer måste anslutas på avstånd till givaren inuti ett MR-hål med hjälp av MRI-kompatibla material. Problem med plastskevhet, brist på tillräckligt med utrymme inuti hålet för att implementera robust dimensionerade komponenter och otillräckligt utrymme för att ändra målpositionerna över hela hjärnan har påverkat målsökningsnoggrannheten i tidigare arbete.
För att lösa dessa problem togs ett beslut om att utföra avbildning i MR och FUS-BBBO-administrering utanför skannern. För att möjliggöra MRI-vägledning placerades mössen i en 3D-printad fasthållning som hade en MRI-synlig målinriktningsguide som kunde användas för att lokalisera mushjärnstrukturerna både i MRT och i stereotax-koordinatrymden. Eftersom både musskallen och inriktningsguiden är ordentligt fastsatta på öronstångshållare (Figur 1a,b), kan en målinriktningsguide användas för att korrelera rumsliga koordinater inom MRT-bilden och nollställa de stereotaktiska instrumenten. Fasthållningsanordningen har inga rörliga delar och innehåller ingen givare, vilket gjorde det möjligt för oss att göra den både robust och tillräckligt liten för att passa in i en MR och tog bort signalstörningar från givarens elektronik. Utrymmet inuti målguiden har urholkats eftersom det 3D-printade stödet för vissa material är synligt i MRT (Figur 1c). Hål i enheten infördes för att möjliggöra stereoskattekalibrering (figur 3). Ultraljudsgivaren fästes på en elektrodhållare för en stereoskatt och inriktningen utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 4 (figur 1d). Givaren bör stödjas längs sin längd med hölje av öronstänger, vilket förhindrar avvikelser från nivåplanet. Inriktningen i dorso-ventral riktning kan uppnås med hjälp av fasförskjutningar i en ringformig matris.
Den praktiska målprecisionen bestäms av ultraljudsfokusering och dämpning av skallen. FUS-BBBO-proceduren har beskrivits i detalj för råttor 11 och har implementerats i ett antal andra modellorganismer23,33,34 och i människor 16,17. Förhållandet mellan ultraljudsfokusstorlek omvänt proportionellt mot frekvensen, där högre frekvenser kan resultera i mer exakt leverans. Dämpningen av skallen ökar dock med frekvenserna35 vilket kan leda till att skallen värms upp och att de kortikala områdena skadas. Den exakta inriktningsstrategin beror på hjärnans plats. De platser där ett fullt bredd halvt maximalt tryck passar in i hjärnvävnaden möjliggör förutsägbar och säker BBB-öppning i många hjärnstrukturer som striatum, mitthjärnan och hippocampus. Regioner nära hjärnans bas utgör en särskild utmaning hos möss. Mushjärnan mäter cirka 8-10 mm i dorso-ventral riktning, vilket är jämförbart med den maximala storleken på många kommersiellt tillgängliga givare. Följaktligen kan inriktning på botten av skallen leda till ultraljudsreflektion från benen och luften som finns i hörselgångarna, munnen eller luftstrupen, vilket kan leda till oförutsägbara mönster av högt och lågt tryck36. Vissa av dessa tryck kan passera en tröghetskavitationströskel som har visat sig orsaka blödning och vävnadsskada37. För att rikta in sig på regioner som ligger nära skallbasen kan det vara att föredra att använda intersektionell ATAC7, där intersektionell genetik38 används för att begränsa genuttrycket till ett mindre område än det som är måltavla för FUS-strålen. I det publicerade exemplet med intersektionell ATAC har ett transgent djur som uttrycker ett genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerga celler riktats mot ultraljud i den del av regionen som innehåller dopaminerga celler. Slutligen kan de kortikala regionerna riktas mot FUS, men diffraktion och reflektion av ultraljud kan förekomma vilket leder till ojämna tryckprofiler. Detta protokoll omfattar inte inriktning på kortikala regioner eftersom det kommer att vara starkt beroende av de arter som används. En viss inriktning av cortex ovanför hippocampus 7 (t.ex. figur 7) har dock observerats, vilket tyder på att det är möjligt åtminstone hos möss.
Valet av en kemogenetisk aktivator och dosering beror på de specifika experimentella behoven. Ett antal studier, inklusive en av författarnas studier7, visade inget signifikant icke-specifikt svar39,40, medan högre doser (t.ex. 10 mg/kg) kan ge biverkningar, åtminstone i vissa fall41. Men som med alla beteendeexperiment är korrekta kontroller31 viktiga på grund av potentiell off-target-aktivitet av CNO och dess metaboliter42. Sådana kontroller kan innefatta administrering av CNO- och saltlösningskontroller till djur som uttrycker DREADDs och administrering av CNO till vildtypsdjur eller, i vissa specifika fall, en jämförelse av ipsi- och kontralaterala platser i hjärnan som uttrycker respektive inte uttrycker kemogenetiska receptorer. Dessutom avslöjade ny forskning ett antal nya DREADD-agonister med förbättrad specificitet28,29,43. Andra kemogenetiska receptorer 5,25,44 kan också användas i samband med ATAC-proceduren.
Histologisk utvärdering av genuttryck är nödvändig efter döden för varje djur. En liten andel av djuren uppvisar dåligt genuttryck efter FUS-BBBO7. Dessutom är det nödvändigt att visa den rumsliga noggrannheten och specificiteten av genuttryck eftersom felinriktning är möjlig. Observera att vissa AAV:er kan visa retrograd eller anterograd spårningsförmåga45 och kan orsaka transfektion långt från den plats som är riktad med ultraljud trots korrekt ultraljudsinriktning. Om den uttryckta kemogenetiska receptorn är sammansmält med eller samuttrycker en fluorofor, kan avbildning av fluoroforen i vävnadssnitt vara tillräcklig för att utvärdera lokalisering och uttrycksintensitet. Många fluorescerande proteiner skadas dock av vävnadsfixeringsprocessen, och immunfärgning för mCherry-protein som ofta används med DREADDs gav bättre signal i tidigarestudier7. Slutligen, på grund av tätheten av neuroner i vissa delar av hjärnan (t.ex. granulärt cellager i hippocampus), kan det vara fördelaktigt att använda nutydligt lokaliserade fluoroforer uttryckta under IRES, i motsats till fusioner, för att utföra cellräkningar eftersom kärnor lätt kan segmenteras och motfärgas med kärnfärgningar, såsom DAPI eller TO-PRO-3. För att utvärdera neuromodulering genom c-Fos-färgning är det absolut nödvändigt att utföra nukleär motfärgning och räkna c-Fos-positiva kärnor, snarare än någon fluorescenssignal. I vissa fall kan cellulärt skräp visa fluorescens och förvirra mätningarna av positiva celler.
Begränsningar av läkemedlet och genleveransen med FUS-BBBO inkluderar lägre upplösning än tillförsel med invasiva intrakraniella injektioner och behovet av större mängder injicerade läkemedel eller virala vektorer. Dessutom, medan en direkt injektion i hjärnan resulterar i exklusiv tillförsel till ett injicerat ställe, använder FUS-BBBO en intravenös väg som resulterar i möjlig leverans till perifera vävnader. Begränsningar med att använda kemogenetik för neuromodulering inkluderar en långsam tidsskala, vilket kan vara otillräckligt för vissa beteendeprotokoll som kräver snabba förändringar i intensiteten av neuromodulering.
Disclosures
Ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flera 3D-printade komponenter designades ursprungligen av Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrike). Författaren tackar John Heath (Caltech) och Margaret Swift (Caltech) för teknisk hjälp med att förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
