Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning
Summary
Här beskriver vi en enkel, billig och snabb clearing metod för att lösa 3D-strukturen för både mus och mänskliga vita fettvävnad med hjälp av en kombination av markörer för att visualisera vasculature, kärnor, immunceller, nervceller och lipid-droplet coat proteiner genom fluorescerande imaging.
Abstract
Fetma är en stor världsomspännande folkhälsofråga som ökar risken för att utveckla hjärt-kärlsjukdomar, typ-2 diabetes, och leversjukdomar. Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad (AT) massa på grund av adipocyte hyperplasi och/eller hypertrophia, vilket leder till djupgående remodeling av dess tredimensionella struktur. Faktum är att maximal kapacitet AT att expandera under fetma är avgörande för utvecklingen av fetma-associerade patologier. Detta AT expansion är en viktig homeostatisk mekanism för att möjliggöra anpassning till ett överskott av energiintag och för att undvika skadliga lipid spillover till andra metaboliska organ, såsom muskler och lever. Därför är förståelsen av den strukturella ombyggnad som leder till misslyckandet med AT-expansion en grundläggande fråga med hög klinisk tillämplighet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och snabb clearing metod som rutinmässigt används i vårt laboratorium för att utforska morfologi av mus och mänskliga vita fettvävnad genom fluorescerande avbildning. Denna optimerade AT-clearingmetod utförs enkelt i alla vanliga laboratorium som är utrustade med en kemisk huva, en temperaturkontrollerad orbitalskaktor och ett fluorescerande mikroskop. Dessutom är de kemiska föreningar som används lätt tillgängliga. Viktigt, denna metod gör det möjligt för en att lösa 3D AT struktur genom färgning olika markörer för att specifikt visualisera adipocyter, neuronala och vaskulära nätverk, och den medfödda och adaptiva immunceller distribution.
Introduction
Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad massa och har blivit en stor världsomspännande folkhälsofråga, med tanke på att personer med fetma har ökad risk att utveckla hjärt-kärlsjukdom, typ-2 diabetes, leversjukdomar och vissa cancerformer.
En grundläggande fysiologisk funktion av fettvävnad är att modulera hela kroppen glukos och lipid homeostas1,2. Under utfodringsperioden lagrar adipocyterna (dvs. de viktigaste cellerna i fettvävnaden) överskottet av glukos och lipider som en måltid tillhandahåller i triglycerider. Under fasta, adipocyterna bryta ner triglycerider till icke-förestrad fettsyror och glycerol att upprätthålla energibehovet av kroppen. Under utvecklingen av fetma, fettvävnad expandera genom att öka storleken (hypertrophia) och /eller antalet (hyperplasi) av adipocyter1, för att öka deras lagringskapacitet. När utbyggnaden av fettvävnad når sin gräns, en konstant mycket varierande bland patienter, de återstående lipider ackumuleras i andra metaboliska organ inklusive muskler och lever3,4, vilket leder till deras funktionella misslyckande och initierar fetma-relaterade hjärt-metaboliska komplikationer1,5. Därför är det en viktig klinisk utmaning att identifiera de mekanismer som styr fettvävnadsexpansion.
De morfologiska modifieringarna som dokumenteras inom fettvävnader under fetma är kopplade till dess patologiska dysfunktion. Flera färgningsprocedurer har använts för att beskriva vävnadsorganisationen av fettvävnaden, inklusive aktin6, kärlmarkörer7, lipid-droplet markörer8, och specifika immun cell markörer9,10. Men på grund av den enorma diametern av adipocyter (50 till 200 μm)11, är det viktigt att analysera en stor del av hela vävnaden i tre dimensioner för att exakt analysera de dramatiska strukturella AT förändringar som observerats under fetma. Men eftersom ljuset inte penetrerar en ogenomskinlig vävnad, är bildbehandling i 3D inom en stor vävnadsprover med hjälp av fluorescensmikroskopi inte möjligt. Metoder för vävnad clearing för att göra dem transparenta har rapporterats i litteraturen (för en översyn,se 12) tillåter en att rensa vävnader och att utföra djupgående, hela vävnad fluorescens mikroskopi. Dessa metoder erbjuder oöverträffade möjligheter att bedöma 3D cellulära organisationen i friska och sjuka vävnad. Var och en av de beskrivna metoderna har fördelar och nackdelar, och behöver därför väljas noggrant beroende på den studerade vävnaden (för en genomgång, se13). Vissa tillvägagångssätt kräver faktiskt en lång inkubationstid och/eller användning av material eller föreningar som antingen är dyra, giftiga eller svåra att fåtag på 14,15,16,17,18,19. Dra nytta av en av de första föreningarna som används för ett sekel sedan av Werner Spalteholz att rensa vävnader20, vi inrätta en användarvänlig och billig protokoll som är mycket väl anpassad för röjning av alla mus och mänskliga fettvävnad depåer i alla laboratorium med typisk utrustning inklusive en kemisk huva, en temperatur-kontrollerade orbital shaker och ett konfokalt mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De modifieringar som sker inom fettvävnaden under loppet av patologisk progression, såsom fetma, är grundläggande för förståelsen av mekanismerna bakom patologin. Banbrytande studier som avslöjade sådana mekanismer i fettvävnad har baserats på globala tillvägagångssätt såsom hela fettvävnaden proteomik21, flödescytometri22,23, och transkriptomik24,25. Dessutom har …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av INSERM, Université Côte d’Azur, och genom bidrag från den franska nationella forskningsbyrån (ANR) genom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 “Systèmes Complexes” och Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), och Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi tackar också Imaging Core Facility of C3M som finansieras av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes och Région PACA, och som också stöds av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA). Vi tackar Marion Dussot för teknisk hjälp vid vävnadsberedning. Vi tackar Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Referências
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
