Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.
Abstract
Obesitas is een belangrijk wereldwijd probleem op het gebied van de volksgezondheid dat het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten, diabetes type-2 en leverziekten verhoogt. Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel (AT) massa als gevolg van adipocyte hyperplasie en / of hypertrophia, wat leidt tot een grondige verbouwing van de driedimensionale structuur. Inderdaad, de maximale capaciteit van AT om uit te breiden tijdens obesitas is cruciaal voor de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde pathologieën. Deze AT-expansie is een belangrijk homeostatisch mechanisme om aanpassing aan een overmaat aan energie-inname mogelijk te maken en om schadelijke lipide-overloop naar andere metabole organen, zoals spieren en lever, te voorkomen. Daarom is het begrijpen van de structurele verbouwing die leidt tot het falen van AT-expansie een fundamentele vraag met een hoge klinische toepasbaarheid. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige en snelle clearingmethode die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om de morfologie van muis en menselijk wit vetweefsel te verkennen door fluorescerende beeldvorming. Deze geoptimaliseerde AT clearing methode is gemakkelijk uit te voeren in elk standaard laboratorium uitgerust met een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een fluorescerende microscoop. Bovendien zijn de gebruikte chemische verbindingen direct beschikbaar. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de 3D AT-structuur op te lossen door verschillende markers te bevlekken om specifiek de adipocyten, de neuronale en vasculaire netwerken en de aangeboren en adaptieve immuuncellenverdeling te visualiseren.
Introduction
Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel massa en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde volksgezondheid probleem, gezien het feit dat mensen met obesitas hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, type-2 diabetes, leverziekten en sommige vormen van kanker.
Een fundamentele fysiologische functie van vetweefsel is het moduleren van lichaam-lichaam glucose en lipide homeostase1,2. Tijdens de voederperiode slaan de adipocyten (d.w.z. de belangrijkste cellen van het vetweefsel) het teveel aan glucose en lipiden op die door een maaltijd in triglyceriden worden verstrekt. Tijdens het vasten breken de adipocyten de triglyceriden af in niet-gestreelde vetzuren en glycerol om de energievraag van het lichaam te ondersteunen. Tijdens de ontwikkeling van obesitas breidt vetweefsel uit door de grootte (hypertrophia) en/of het aantal (hyperplasie) van adipocyten1te vergroten, om hun opslagcapaciteit te vergroten. Wanneer de expansie van vetweefsel zijn limiet bereikt, een constante zeer variabele bij patiënten, de resterende lipiden accumuleert in andere metabole organen, waaronder spieren en lever3,4, wat leidt tot hun functionele falen en het initiëren van obesitas-gerelateerde cardio-metabole complicaties1,5. Daarom is het identificeren van de mechanismen die de expansie van vetweefsel regelen een belangrijke klinische uitdaging.
De morfologische modificaties gedocumenteerd in vetweefsels tijdens obesitas zijn gekoppeld aan zijn pathologische disfunctie. Verschillende kleuringsprocedures zijn gebruikt om de weefselorganisatie van het vetweefsel te beschrijven, waaronder actine6, vasculaire markers7, lipidedruppelmarkers8en specifieke immuuncelmarkers9,10. Vanwege de enorme diameter van adipocyten (50 tot 200 μm)11is het echter essentieel om een groot deel van het hele weefsel in drie dimensies te analyseren om de dramatische structurele AT-veranderingen die tijdens obesitas worden waargenomen, nauwkeurig te analyseren. Omdat het licht echter geen ondoorzichtig weefsel binnendringt, is beeldvorming in 3D binnen een groot weefselmonster met behulp van fluorescentiemicroscopie niet mogelijk. Methoden van weefselclearing om ze transparant te maken zijn gemeld in de literatuur (voor een onderzoek, zie12) waardoor men weefsels kan wissen en diepgaande, hele weefselfluorescentiemicroscopie kan uitvoeren. Deze methoden bieden ongekende mogelijkheden om de 3D cellulaire organisatie in gezond en ziek weefsel te beoordelen. Elk van de beschreven methoden hebben voor- en nadelen en moet daarom zorgvuldig worden geselecteerd, afhankelijk van het bestudeerde weefsel (zie13). Sommige benaderingen vereisen immers een lange incubatietijd en/of het gebruik van materialen of verbindingen die duur, giftig of moeilijk te verkrijgen zijn14,15,16,17,18,19. Profiterend van een van de eerste verbindingen die werner Spalteholz een eeuw geleden gebruikte om weefsels20te wissen, hebben we een gebruiksvriendelijk en goedkoop protocol opgezet dat zeer goed is aangepast voor het opruimen van alle muis- en menselijke vetweefseldepots in elk laboratorium met typische apparatuur, waaronder een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een confocale microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De wijzigingen die zich voordoen in het vetweefsel in de loop van pathologische progressie, zoals die van obesitas, is fundamenteel voor het begrip van de mechanismen achter de pathologie. Baanbrekende studies die dergelijke mechanismen in vetweefsel aan het licht brachten, zijn gebaseerd op globale benaderingen zoals gehele vetweefselproteomics21, flow cytometrie22,23en transcriptomics24,<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door INSERM, Université Côte d’Azur, en door subsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via de Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), het programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 “Systèmes Complex academie 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), en het Young Investigator Program naar J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, en die ook wordt ondersteund door het IBISA Microscopie en Imaging Platform Côte d’Azur (MICA). Wij danken Marion Dussot voor technische hulp bij weefselbereiding. Wij danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, voor het bewijs lezen van het manuscript.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Referências
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
