Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D
Summary
Ici, nous décrivons une méthode simple, peu coûteuse et rapide de compensation pour résoudre la structure 3D de la souris et du tissu adipeux blanc humain en utilisant une combinaison de marqueurs pour visualiser la vascularisation, les noyaux, les cellules immunitaires, les neurones, et les protéines de couche de lipide-goutte par imagerie fluorescente.
Abstract
L’obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier qui augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et des maladies du foie. L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse de tissu adipeux (AT) due à l’hyperplasie d’adipocyte et/ou à l’hypertrophie, menant au remodelage profond de sa structure tridimensionnelle. En effet, la capacité maximale d’AT à se développer pendant l’obésité est essentielle au développement des pathologies associées à l’obésité. Cette expansion AT est un mécanisme homéostatique important pour permettre l’adaptation à un excès d’apport énergétique et pour éviter les retombées délétères lipidiques à d’autres organes métaboliques, tels que les muscles et le foie. Par conséquent, la compréhension du remodelage structurel qui conduit à l’échec de l’expansion AT est une question fondamentale avec une applicabilité clinique élevée. Dans cet article, nous décrivons une méthode de compensation simple et rapide qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour explorer la morphologie de la souris et du tissu adipeux blanc humain par imagerie fluorescente. Cette méthode de compensation AT optimisée est facilement réalisée dans n’importe quel laboratoire standard équipé d’une hotte chimique, d’un shaker orbital à température contrôlée et d’un microscope fluorescent. De plus, les composés chimiques utilisés sont facilement disponibles. Fait important, cette méthode permet de résoudre la structure 3D AT en tachant divers marqueurs pour visualiser spécifiquement les adipocytes, les réseaux neuronaux et vasculaires, et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires.
Introduction
L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse tissulaire adipeuse et est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde entier, étant donné que les personnes souffrant d’obésité ont un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, les maladies du foie et certains cancers.
Une fonction physiologique fondamentale du tissu adipeux est de moduler l’homéostasie du glucose entier du corps et des lipides1,2. Pendant la période d’alimentation, les adipocytes (c.-à-d. les principales cellules du tissu adipeux) stockent l’excès de glucose et de lipides fournis par un repas dans les triglycérides. Pendant le jeûne, les adipocytes décomposent les triglycérides en acides gras non estérifiés et en glycérol pour soutenir la demande énergétique du corps. Pendant le développement de l’obésité, les tissus adipeux se développent en augmentant la taille (hypertrophie) et/ou le nombre (hyperplasie) des adipocytes1,pour augmenter leur capacité de stockage. Lorsque l’expansion du tissu adipeux atteint sa limite, une constante très variable chez les patients, les lipides restants s’accumulent dans d’autres organes métaboliques, y compris les muscles et le foie3,4, conduisant à leur échec fonctionnel et l’initiation de l’obésité liées complications cardio-métaboliques1,5. Par conséquent, l’identification des mécanismes qui régissent l’expansion des tissus adipeux est un défi clinique clé.
Les modifications morphologiques documentées dans les tissus adipeux pendant l’obésité sont liées à son dysfonctionnement pathologique. Plusieurs procédures de coloration ont été utilisées pour décrire l’organisation tissulaire du tissu adipeux, y compris l’actine6, les marqueurs vasculaires7, les marqueurs de gouttelettes de lipides8, et les marqueurs spécifiques de cellules immunitaires9,10. Cependant, en raison de l’énorme diamètre des adipocytes (50 à 200 μm)11, il est essentiel d’analyser une grande partie du tissu entier en trois dimensions afin d’analyser avec précision les changements structurels dramatiques AT observés pendant l’obésité. Cependant, comme la lumière ne pénètre pas dans un tissu opaque, l’imagerie en 3D à l’intérieur d’un grand échantillon de tissus utilisant la microscopie par fluorescence n’est pas possible. Des méthodes de compensation des tissus pour les rendre transparentes ont été rapportées dans la littérature (pour un examen, voir12)permettant de dégager des tissus et d’effectuer en profondeur, la microscopie de fluorescence de tissu entier. Ces méthodes offrent des occasions sans précédent d’évaluer l’organisation cellulaire 3D dans les tissus sains et malades. Chacune des méthodes décrites présente des avantages et des inconvénients et doit donc être soigneusement sélectionnée en fonction du tissu étudié (pour un examen, voir13). En effet, certaines approches nécessitent une longue période d’incubation et/ou l’utilisation de matériaux ou de composés coûteux, toxiques ou difficiles à obtenir14,,15,16,17,18,19. Profitant de l’un des premiers composés utilisés il y a un siècle par Werner Spalteholz pour dégager les tissus20,nous avons mis en place un protocole convivial et peu coûteux qui est très bien adapté pour le nettoyage de tous les dépôts de tissus adipeux souris et humains dans n’importe quel laboratoire avec un équipement typique, y compris une hotte chimique, un shaker à température contrôlée et un microscope confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modifications qui se produisent dans le tissu adipeux au cours de la progression pathologique, comme celle de l’obésité, est fondamentale pour la compréhension des mécanismes derrière la pathologie. Des études pionnières qui ont révélé de tels mécanismes dans les tissus adipeux ont été basées sur des approches globales telles que la protéomique tissulaire adipeuse entière21, cytométrie de flux22,23, et transcriptomic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’INSERM, Université Côte d’Azur, et grâce à des subventions de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) par le biais des Investissements pour le futur Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), le programme UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via l’Académie 2 « Systèmes Complexes » et l’Académie 4 « Complexité et diversité du vivant », Fondation pour la Recherche Médicale (Équipe FRM DEQ20180839587) et programme des jeunes chercheurs à J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Nous remercions également le Centre d’imagerie de C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, et qui est également soutenu par la Plate-forme de microscopie et d’imagerie IBISA Côte d’Azur (MICA). Nous remercions Marion Dussot pour son aide technique dans la préparation des tissus. Nous remercions Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, pour la lecture de la preuve du manuscrit.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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