Здесь мы описываем простой, недорогой и быстрый метод очистки для решения 3D-структуры как мыши, так и человеческой белой жировой ткани, используя комбинацию маркеров для визуализации сосудов, ядер, иммунных клеток, нейронов и белков липидно-капельного слоя с помощью флуоресцентных изображений.
Ожирение является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, что повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа 2 и заболеваний печени. Ожирение характеризуется увеличением жировой ткани (AT) массы из-за гиперплазии адипоцитов и/ или гипертрофии, что приводит к глубокой реконструкции его трехмерной структуры. Действительно, максимальная способность AT расширяться во время ожирения имеет решающее значение для развития связанных с ожирением патологий. Это расширение AT является важным гомеостативным механизмом, позволяющим адаптироваться к избытку потребления энергии и избежать пагубного распространения липидов на другие метаболические органы, такие как мышцы и печень. Таким образом, понимание структурной реконструкции, которая приводит к провалу расширения AT является фундаментальным вопросом с высокой клинической применимостью. В этой статье мы описываем простой и быстрый метод очистки, который обычно используется в нашей лаборатории для изучения морфологии мыши и человеческой белой жировой ткани с помощью флуоресцентных изображений. Этот оптимизированный метод очистки AT легко выполняется в любой стандартной лаборатории, оснащенной химическим капюшоном, контролируемым температурой орбитальным шейкером и флуоресцентным микроскопом. Кроме того, используемые химические соединения легко доступны. Важно отметить, что этот метод позволяет решить 3D AT структуры путем окрашивания различных маркеров специально визуализировать адипоцитов, нейронных и сосудистых сетей, а также врожденные и адаптивные распределения иммунных клеток.
Ожирение характеризуется увеличением жировой массы тканей и стало одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, учитывая, что люди с ожирением имеют повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа-2, заболеваний печени и некоторых видов рака.
Фундаментальная физиологическая функция жировой ткани заключается в модулировать глюкозу всего тела и липидный гомеостаз1,,2. В период кормления адипоциты (т.е. основные клетки жировой ткани) хранят избыток глюкозы и липидов, предоставляемых при приеме пищи в триглицериды. Во время поста адипоциты распадают триглицериды на неестерифицированные жирные кислоты и глицерол для поддержания спроса на энергию в организме. Во время развития ожирения жировая ткань расширяется за счет увеличения размера (гипертрофии) и/или количества (гиперплазии) адипоцитов1,чтобы увеличить их емкость. Когда расширение жировой ткани достигает своего предела, постоянная высокая переменная среди пациентов, остальные липиды накапливается в других метаболическихорганов,включаямышцы и печень 3,4, что приводит к их функциональной недостаточности и инициирования связанных с ожирениемкардио-метаболических осложнений 1,5. Таким образом, определение механизмов, которые регулируют расширение жировой ткани является ключевой клинической проблемой.
Морфологические изменения, задокументированные в жировых тканях при ожирении, связаны с его патологической дисфункцией. Несколько процедур окрашивания были использованы для описания организации тканей жировой ткани, в том числеактин 6, сосудистыемаркеры 7, липидно-капельныемаркеры 8, и конкретные маркерыиммунных клеток 9,10. Однако, из-за огромного диаметра адипоцитов (от 50 до 200мкм) 11, важно проанализировать большую часть всей ткани в трех измерениях, с тем чтобы точно проанализировать драматические структурные изменения AT наблюдается во время ожирения. Однако, поскольку свет не проникает в непрозрачные ткани, визуализация в 3D в больших образцах тканей с использованием флуоресцентной микроскопии невозможна. Методы очистки тканей, чтобы сделать их прозрачными были зарегистрированы в литературе (для обзора,см. 12), что позволяет очистить ткани и выполнять углубленную, всю ткань флуоресценции микроскопии. Эти методы предлагают беспрецедентные возможности для оценки 3D клеточной организации в здоровых и больных тканях. Каждый из описанных методов имеет преимущества и недостатки, и поэтому должны быть тщательно отобраны в зависимости от изученной ткани (для обзора,см. 13). Действительно, некоторые подходы требуют длительного инкубационный период и / или использование материалов или соединений, которые являются либо дорогими, токсичнымиили трудно получить 14,,15,,16,,17,18,19. Воспользовавшись одним из первых соединений, используемых сто лет назад Вернер Spalteholzдля очистки тканей 20, мы создали удобный и недорогой протокол, который очень хорошо приспособлен для очистки всех мыши и человека жировой ткани складов в любой лаборатории с типичным оборудованием, включая химический капюшон, температура контролируемых орбитальный шейкер и конфокальный микроскоп.
Изменения, которые происходят в жировой ткани в течение патологического прогрессирования, таких как ожирение, имеет основополагающее значение для понимания механизмов, стоящих за патологией. Новаторские исследования, которые показали такие механизмы в жировой ткани были основаны на …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана INSERM, Лазурным университетом, и гранты От Французского национального исследовательского агентства (ANR) через Инвестиции в будущее Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), программа UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) через Академию 2 “Комплексы Системеса” и Академия 4 “Комплекс и диверсификация дю Вивант”, Фонд за Recherche M’dical (Кипе FRM DE-20180839587), и Программа молодых следователей j.G. (ANR18-CE14-0035-01-01-ГИЛЛЕРОН). Мы также благодарим Основной фонд визуализации C3M, финансируемый Департаментом По делам Альп-морей и РКА, который также поддерживается Микроскопией IBISA и Платформой изображений Лазурный берег (MICA). Мы благодарим Марион Дусзо за техническую помощь в подготовке тканей. Мы благодарим Эбби Каттрис, Международную научную видимость UCA, за доказательство прочтения рукописи.
1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |