Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması
Summary
Burada, hem fare hem de insan beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu yapısını çözüme kavuşturmak için basit, ucuz ve hızlı bir temizleme yöntemi tanımlıyoruz.
Abstract
Obezite kardiyovasküler hastalıklar, tip-2 diyabet ve karaciğer hastalıkları geliştirmek için risk artar önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunudur. Obezite, adiposit hiperplazi ve/veya hipertrophiye bağlı yağ dokusu (AT) kütlesindeki artış ile karakterizedir ve üç boyutlu yapısının derin bir şekilde yenilenmesine yol açar. Gerçekten de, obezite sırasında genişletmek için AT maksimal kapasitesi obezite ile ilişkili patolojilerin gelişimi için çok önemlidir. Bu AT genişleme ve enerji alımının aşırı adaptasyon sağlamak için önemli bir homeostatik mekanizma diğer metabolik organlara zararlı lipid dökülmesini önlemek için, kas ve karaciğer gibi. Bu nedenle, AT genişlemesinin başarısızlığına yol açan yapısal yeniden şekillendirmenin anlaşılması, yüksek klinik uygulanabilirliği olan temel bir sorudur. Bu makalede, floresan görüntüleme ile fare ve insan beyaz yağ dokusunun morfolojisini keşfetmek için rutin olarak laboratuarımızda kullanılan basit ve hızlı bir temizleme yöntemini açıklıyoruz. Bu optimize AT temizleme yöntemi kolayca bir kimyasal başlık, sıcaklık kontrollü orbital shaker ve floresan mikroskop ile donatılmış herhangi bir standart laboratuvarda gerçekleştirilir. Ayrıca, kullanılan kimyasal bileşikler kolayca kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem özellikle adipositler, nöronal ve vasküler ağlar ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri dağılımı görselleştirmek için çeşitli belirteçleri boyama tarafından 3D AT yapısını çözmek için izin verir.
Introduction
Obezite yağ dokusu kütlesinde bir artış ile karakterizedir ve önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunu haline gelmiştir, obezite olan kişilerin kardiyovasküler hastalık gelişme riskini artırdığı göz önüne alındığında, tip-2 diyabet, karaciğer hastalıkları ve bazı kanserler.
Yağ dokusunun temel fizyolojik fonksiyonu tüm vücut glikoz ve lipid homeostazı modüle etmektir1,2. Beslenme döneminde, adipositler (yani, yağ dokusunun ana hücreleri) trigliserid içine bir yemek tarafından sağlanan glikoz ve lipidlerin aşırı depolar. Oruç sırasında, adipositler vücudun enerji talebini sürdürmek için esterleştirilmiş olmayan yağ asitleri ve gliserol içine trigliserid yıkmak. Obezite gelişimi sırasında, yağ dokusu büyüklüğü artırarak genişletmek (hipertrophi) ve / veya sayı (hiperplazi) adipositler1, depolama kapasitesini artırmak için. Yağ dokusunun genişlemesi sınırına ulaştığında, hastalar arasında sürekli bir son derece değişken, kalan lipidler kas ve karaciğer 3 dahil olmak üzere diğer metabolik organlara birikir3,4, fonksiyonel yetmezliğine yol açan ve obezite ile ilgili kardiyo-metabolik komplikasyonlar başlatılması1,5. Bu nedenle, yağ dokusu genişlemesi yöneten mekanizmaların belirlenmesi önemli bir klinik sorundur.
Obezite sırasında yağ dokularında belgelenen morfolojik modifikasyonlar patolojik disfonksiyonu ile bağlantılıdır. Çeşitli boyama prosedürleri adipoz doku organizasyonu tanımlamak için kullanılmıştır, aktin dahil6, vasküler belirteçleri7, lipid damlacık belirteçleri8, ve spesifik bağışıklık hücre belirteçleri9,10. Ancak, adipositlerin büyük çapı nedeniyle (50-200 μm)11, obezite sırasında gözlenen dramatik yapısal AT değişiklikleri doğru analiz etmek için üç boyutlu tüm doku büyük bir bölümünü analiz etmek esastır. Ancak, ışık opak bir doku nüfuz etmez çünkü, floresan mikroskopi kullanarak büyük bir doku örnekleri içinde 3D görüntüleme mümkün değildir. Doku temizleme yöntemleri onları şeffaf hale getirmek için literatürde bildirilmiştir (bir inceleme için, bakınız12) dokuları temizlemek ve derinlemesine gerçekleştirmek için izin, tüm doku floresan mikroskopi. Bu yöntemler sağlıklı ve hastalıklı dokuda 3D hücresel organizasyonu değerlendirmek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu nedenle incelenen dokuya bağlı olarak dikkatle seçilmesi gerekir (gözden geçirme içinbkz. 13). Nitekim, bazı yaklaşımlar uzun bir kuluçka dönemi ve / veya pahalı, toksik ya da 14,15,16,,17,18,19elde etmek zor malzeme veya bileşiklerin kullanımını gerektirir.19 Bir yüzyıl önce Werner Spalteholz tarafından dokuları temizlemek için kullanılan ilk bileşiklerden birinden yararlanarak20, biz çok iyi bir kimyasal başlık, bir sıcaklık kontrollü orbital shaker ve konfokal mikroskop da dahil olmak üzere tipik ekipman ile herhangi bir laboratuvarda tüm fare ve insan yağ dokusu depolarının temizlenmesi için uyarlanmış bir kullanıcı dostu ve ucuz protokol kurmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obezite gibi patolojik ilerleme boyunca yağ dokusu içinde meydana gelen değişiklikler, patolojinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasında temel dir. Yağ dokusunda bu tür mekanizmaları ortaya öncü çalışmalar gibi tüm yağ dokusu proteomics21gibi küresel yaklaşımlara dayalı olmuştur , akış sitometri22,23, ve transkripsiyon24,25. Buna ek olarak, histolojik …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma INSERM tarafından desteklenmiştir, Université Côte d’Azur ve Gelecek Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), program UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) Akademi 2 “Systèmes Complexes” ve Akademi 4 “Complexité dalgıç etsité ant revivant du”, için Yatırımlar aracılığıyla Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibeleri ile, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) ve J.G.’ye Genç Araştırmacı Programı (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes ve Région PACA tarafından finanse edilen ve IBISA Mikroskobu ve Görüntüleme Platformu Côte d’Azur (MICA) tarafından desteklenen C3M’nin Görüntüleme Çekirdek Tesisine de teşekkür ederiz. Marion Dussot’a doku hazırlığında teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Abby Cuttriss, UCA Uluslararası Bilimsel Görünürlük, makalenin kanıt okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Referências
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
