Summary
Denne protokollen presenterer choroid spirende analyse, en ex vivo modell av mikrovaskulær spredning. Denne analysen kan brukes til å vurdere veier involvert i å spre koroide mikrokar og vurdere medikamentell behandling ved hjelp av vill type og genmodifisert musevev.
Abstract
Patologisk choroidal angiogenese, et fremtredende trekk ved aldersrelatert makuladegenerasjon, fører til synshemming og blindhet. Endotelcelle (EC) spredningsanalyser ved hjelp av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECer) eller isolerte primære retinale ECer er mye brukt in vitro-modeller for å studere retinal angiogenese. Imidlertid er det teknisk utfordrende å isolere rene murine retinale endotelceller, og retinale ECer kan ha forskjellige spredningsresponser enn koroidale endotelceller og forskjellige celle/celleinteraksjoner. En svært reproduserbar ex vivo choroidal spirende analyse som en modell av choroidal mikrovaskulær spredning ble utviklet. Denne modellen inkluderer samspillet mellom choroid vaskulatur (EC, makrofager, pericytter) og retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants er isolert og inkubert i vekstfaktorredusert basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium endres annenhver dag og choroid spirende er kvantifisert på dag 6. Bildene av individuelle choroid explant er tatt med en invertert fase mikroskop og spireområdet kvantifiseres ved hjelp av en semi-automatisert makro plug-in til ImageJ programvare utviklet i dette laboratoriet. Denne reproduserbare ex vivo choroidal spirende analysen kan brukes til å vurdere forbindelser for potensiell behandling og for mikrovaskulær sykdom forskning for å vurdere veier involvert i choroidal mikro fartøy spredning ved hjelp av vill type og genmodifisert musvev.
Introduction
Choroidal angiogenese dysregulering er forbundet med neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)1. Choroid er en mikrovaskulær seng tilstede under retinal pigment epitel (RPE). Det har vist seg at redusert blodstrøm i choroid er forbundet med progresjon av AMD2. Det intrikate forholdet mellom vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homeostase avvevet 3,4,5. Derfor er en reproduserbar analyse modellering koroid mikromiljø kritisk for studiet av neovaskulær AMD.
Ex vivo angiogenese analyser og in vitro endotelcellekulturer kan utfylle studier av mikrovaskulær atferd in vivo, for testing av nye legemidler og for studier av patogenese. Endotelceller som humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs), Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC), isolert primær dyrehjerne eller retinale ECer brukes ofte i in vitro-studier for okulær angiogeneseforskning6,7,8. HRMECs spesielt har blitt mye brukt som en modell av in vitro choroidal neovascularization (CNV)9 ved å vurdere endotelspredning, migrasjon, rørformet dannelse og vaskulær lekkasje for å evaluereintervensjoner 6,10. Imidlertid er ECer i kultur begrenset som en modell av CNV på grunn av mangel på interaksjoner med andre celletyper som finnes i choroid og fordi de fleste EC brukes i disse analysene ikke stammer fra choroid. Mus koroide ECer er vanskelig å isolere og vedlikeholde i kultur.
Aortaringanalysen er mye brukt som en modell for makrovaskulær spredning. Vaskulære spirer fra aorta explants inkluderer EC, pericytes og makrofager11. Aorta ring analyse modeller store fartøyet angiogenesebrønn 12,13,14. Det har imidlertid begrensninger som en modell av choroidal neovaskularisering som aortaringer er et makrovaskulært vev som mangler det karakteristiske koroide mikrovaskulære miljøet, og spirer fra store fartøy kan avvike fra spirer fra kapillære nettverk involvert i mikrovaskulær patologi. Nylig publiserte en gruppe en ex-vivo retinal analyse15,16. Selv om det er egnet for retinal neovaskulær sykdom, er det ikke så hensiktsmessig for choroidal neovaskularisering som sett i AMD.
Den koroide spirende analysen ved hjelp av mus RPE, choroid og scleral explanted vev ble utviklet for å bedre modell CNV. Vevet kan lett isoleres fra mus (eller andre arter) øyne17. Denne analysen tillater reproduserbar evaluering av pro- og anti-angiogent potensial av farmakologiske forbindelser og evaluering av rollen til spesifikke veier i choroidal neovaskularisering ved hjelp av vev fra genmodifiserte musog kontroller 18. Denne koroide spirende analysen har blitt referert i mange påfølgendepublikasjoner 9,10,18,19,20. Her demonstreres metoden som er involvert i bruken av denne analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Boston Children's Hospital (ARCH protokollnummer 19-04-3913R).
1. Forberedelse
- Tilsett 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 E/ml) og 5 ml og 10 ml kommersielt tilgjengelige kosttilskudd til 500 ml komplett klassisk medium med serum. Aliquot 50 ml av mediet i utgangspunktet.
MERK: Ikke returner noe medium tilbake til lageret for å unngå kontaminering. - Legg en aliquot av komplett klassisk medium på is.
- Bruk 70% etanol til å rense dissekeringsmikroskopet, tangen og saksen.
- Forbered to cellekulturretter (10 cm), en på disseksjonsmikroskopet, en på is; sett 10 ml komplett klassisk medium i hver tallerken.
2. Eksperimentelle trinn (Figur 1)
- Offer C57BL/6J mus rundt postnatal (P) 20 ved hjelp av 75-100 mg/kg ketamin og 7,5 -10 mg/kg xylazin injisert intraperitoneally. Hold øynene i komplett klassisk medium på is før disseksjon.
- Fjern bindevevet (muskel- og fettvev) og optisk nerve på øyet.
- Bruk en mikrosaks til å skjære 0,5 mm bakre til hornhinnen limbus. Fjern hornhinnen/iriskomplekset, glasslegemet og linsen.
- Lag et 1 mm snitt vinkelrett på den kuttede kanten mot optisk nerve og kutt et omkretsbånd med 1 mm bredde. Skill de sentrale og perifere områdene i komplekset. Bruk tang til å skrelle av netthinnen fra RPE/choroid/sclera kompleks.
- Hold det perifere choroidbåndet i komplett klassisk medium på is; isolere det andre øyet og gjenta prosessen for å kutte et andre bånd.
- Skjær det sirkulære båndet i 6 ~like firkantede stykker (~1 mm x 1 mm).
MERK: Berør aldri noen kant. - Tin basalmembranekstraktet (BME) per fremstillingsinstruksjoner. Tilsett 30 μL/brønn BME i midten av hver brønn av en 24 brønnvevskulturplate. Pass på at dråpet BME danner en konveks kuppel nederst på platen uten å berøre kantene.
MERK: Tin BME over natten i kjøleskap. BME bør være på isen når som helst etter tining. - Plasser vevet midt i BME.
MERK: Ikke flat ut choroid explant; generelt, la vevet utvide seg i BME. Retningen av vevet (skleral side opp eller ned) påvirker ikke det eksperimentelle utfallet. - Inkuber platen ved 37 °C i 10 min for å la gelen stivne.
- Tilsett 500 μL av det komplette klassiske mediet/brønnen.
- Bytt det klassiske mediet annenhver dag (500 μL). Choroid spirende kan observeres etter 3 dager med et mikroskop.
MERK: For behandling av vekstfaktor, sult vevet i 4 timer. Fortynn en studie sammensatte i vekstfaktor-redusert medium (1:200 boost i stedet for 1:50).
3.SWIFT-Choroid datastyrt kvantifisering metode17 (Figur 2)
MERK: En datastyrt metode for å måle området som dekkes av voksende fartøy ble brukt. En makro plugin til ImageJ programvare er nødvendig før kvantifisering (se Tilleggsinformasjon for ytterligere detaljer).
- Åpne choroid spirende bilde med ImageJ og sjekk "| Type| 8-bit" med grå skala.
- Gå til" Bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast (Ctrl/shift/C)" og optimaliser kontrasten.
- Bruk tryllestavfunksjonen til å skissere og fjerne fra bildet choroid vev som finnes i midten av spirene (ved hjelp av hurtigtasten "F1") (Figur 2A, B).
MERK: Sett toleransehastigheten til tryllestaven til 20-30 %. - Fjern bakgrunnen på bildet med de gratis markeringsverktøyene (Figur 2C). Gå til" Bilde | Juster | Terskel (Ctrl /shift/T)". Bruk terskelfunksjonen til å definere mikrovaskulære spirer mot bakgrunnen og periferien (figur 2D).
- Klikk på" F2" og et sammendrag vises. Lagre et bilde av det valgte området ved å klikke på "Lagre". Lagre i samme mappe som det opprinnelige bildet for fremtidig referanse.
- Når en gruppe prøver er målt, kopierer du den registrerte for dataanalyse.
MERK: Det er også mulig å måle området (μm²) med "Analyser | Angi Skala" ved hjelp av bilder med skaleringslinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning av choroid spirende vekst per dag
Vi dissekerte choroid med sclera, innebygd i BME og kultivert dem i 6 dager (Figur 1). Choroidspirende i C57BL/6J-mus fra dag 3 til dag 6 ble undersøkt med et mikroskop og kvantifisert med SWIFT-Choroid en halvautomatisk kvantifiseringsmetode i ImageJ. I et representativt tilfelle var det koroide spireområdet (fartøyene som strekker seg fra skrå, unntatt selve utstrakte) 0,38 mm2 på dag 3 (figur 3A), 1,47 mm2 på dag 4 (figur 3B), 5,62 mm2 på dag 5 (figur 3C) og 10,09 mm2 på dag 6 (figur 3D).
Gratis fettsyrereseptor (FFAR)4 undertrykkelse forverrer koroid neovaskularisering ex vivo.
Effekten av tap av FFAR4 (også kjent som G-protein skrevet reseptor 120) på choroidal vaskulær spirende ble evaluert ved hjelp av choroid spirende analyse18. Choroid, RPE og sclera komplekset ble dissekert fra Ffar4 knock out (-/-) og Ffar4 +/+ mus og kultivert som beskrevet ovenfor. Spireområdet i Ffar4-/- økt koroid vaskulær vekst sammenlignet med Ffar4 +/+ på dag 6 (p = 0,004) ( Figur4A, B). Behandlingen av FFAR4 agonist (1 μM) reduserte koroidspirende område sammenlignet med ubehandlede mus på dag 6 (p = 0,03) (figur 4C,D).
Figur 1: Skjematisk illustrasjon som viser choroid spirende analyse.
Øynene ble først enucleated og kuttet circumferentially ca 0, 5 mm bakre til limbus. Hornhinnen, iris, linsen og glasslegemet ble fjernet. Deretter ble et 1 mm kutt laget fra kanten av øyekoppen mot optisk nerve. Et bånd ble deretter kuttet omkrets ca 1,0 mm bakre til den kuttede kanten og båndet og de perifere områdene av komplekset ble skilt. Båndet ble skåret i ca. 1 mm x 1 mm stykker og innebygd i BME. Deretter ved hjelp av et mikroskop ble mikrovaskulære spirer fra choroidvisualisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SWIFT-Choroid datastyrt kvantifiseringsmetode.
(A, B) Tryllestavfunksjonen ble brukt til å skissere choroidvevet (hvit pil) i midten av spirene, og den ble fjernet digitalt (Hurtigtast "F1"). (C, D) Bakgrunnen på bildet ble fjernet med gratis valgverktøy (svart pil). Mikrovaskulære spirer ble deretter definert ved hjelp av terskelfunksjonen mot bakgrunnen og periferien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mus perifert choroid spirende.
-Det er ikke noe å sipå. Representative bilder av choroid spirer med en C57BL / 6J mus og demonstrasjoner av SWIFT-Choroid metode kvantifisere området av spirene. Spireområdet var 0,38 mm2 på dag 3 (A), 1,47 mm2 på dag 4 (B), 5,62 mm2 på dag 5 (C)og 10,09 mm2 på dag 6 (D). Skala bar; 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fri fettsyrereseptor (FFAR) 4 undertrykkelse forverrer koroid neovaskularisering.
(A) Representative bilder av spirende analyse med choroid fra Free fatty acid receptor (Ffar)4 +/+ sammenlignet med Ffar4 slå ut (-/-) mus: øvre bilde viser choroid av Ffar4 +/+ mens lavere bilde viser Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- viste økt choroid spirende sammenlignet med Ffar4 +/+ mus (n = 6-8). (C) Representative bilder av choroid spirende: øvre bilde demonstrerer kjøretøybehandling (kontroll); det nedre bildet viser FFAR4 agonistbehandling. (D) FFAR4 agonist undertrykt koroidspirering sammenlignet med kontroll (n = 10–12). Vektstenger = 500 μm. Dataene ble analysert av Studentens t-test og ble uttrykt som gjennomsnittet ± SE. * p < 0,05; **p < 0,01. Dette tallet er endret fra Tomita et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende Fil 1: Hvordan lage plugins og snarveier for choroid spirende analyseprogram. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den koroide spirende analysen hjelpemidler forskning i neovaskulær AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker17,21. Choroid explant inkluderer EC, makrofager og pericytes17. I denne analysen bidrar samspillet mellom koroide ECer og tilstøtende celler som RPE-celler, til å belyse mekanismene som er involvert i koroid vaskulær vekst17. Videre reduserer denne reproduserbare og halvautomatiske vurderingsmetoden interobservervariabilitet17.
Den første publiserte studien av ex vivo choroidal vev brukte isolert choroid for å teste farmakologiske inngrep med potensial til å behandle DR og AMD22,23,24,25. Analysen telte antall og lengde på spirende fartøy, som kan være gjenstand for interobserver variasjon. Kvantifiseringsmetoden som er beskrevet her, er derimot standardisert17. Denne analysen av mikrovaskulær choroid angiogenese inkluderer interaktive partnerceller og ekstracellulær matrise. ECs i kultur kan miste mange av sine fysiologiske egenskaper, for eksempel evnen til å danne vaskulærerør 26 som kan skyldes tap av interaksjon med andre celler som RPE. Derfor kan EC in vitro kulturer ikke gjenspeile alle aspekter av koroid neovaskularisering. Aortaringanalysen inkluderer store karendeotelceller og interaktive celler for å evaluere spire fra store kar. Men store fartøyspirer kan ikke nøyaktig reflektere koroidemikrovaskulær sykdom27. Den koroidale spirende analysen er en nærmere representasjon av koroide mikrovaskulære responser.
Det er viktige advarsler. For det første er de perifere choroidkomplekse explant spirene mer konsekvente og vokser mye raskere enn uttred fra de sentraleseksjonene 17. For det andre ble RPE fra choroid ikke fjernet fordi choroid spirer med RPE vokser mye raskere enn uten RPE17. For å forstå virkningen av et stoff på choroid alene, kan analysen uten RPE brukes. Til slutt, når du skisserer bildet av choroid vev og spireområde ved hjelp av tryllestavfunksjonen, er det noen ganger vanskelig å spore området av choroid spirende på grunn av høy bakgrunnsstøy. Det kan være variasjon blant bilder. Derfor, for konsistens, er det viktig å digitalt skape tilstrekkelig kontrast mellom choroid og bakgrunn som vist i figur 2.
Oppsummert har ex vivo choroid sprouting analyse blitt preget og halvautomatisk. Denne metoden gir et eksperimentelt verktøy for AMD-forskning. Denne analysen kan brukes til å screene forbindelser som potensielle behandlinger eller for å vurdere veier involvert i å spre koroide mikrokar ved hjelp av vill type og genmodifisert musevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske avsløringer. Den datastyrte metoden er tilgjengelig gratis for akademiske institusjoner gjennom forfatterne.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
