Summary
Bu protokol, mikrovasküler proliferasyonun ex vivo modeli olan koroid filizlenme testini sunar. Bu tsay koroidal mikro damarlar çoğalan dahil yolları değerlendirmek ve yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak ilaç tedavileri değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Yaşa bağlı makula dejenerasyonunun belirgin bir özelliği olan patolojik koroidal anjiyogenez görme bozukluğu ve körlüğe yol açar. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMECs) veya izole primer retinal EC'ler kullanılarak yapılan endotel hücresi (EC) proliferasyon tahlilleri retinal anjiyogenezi incelemek için in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, saf minrik retinal endotel hücrelerini izole etmek teknik olarak zordur ve retinal eC'ler koroidal endotel hücreleri ve farklı hücre/hücre etkileşimlerinden farklı proliferasyon yanıtlarına sahip olabilir. Koroidal mikrovasküler proliferasyon modeli olarak son derece tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tayini geliştirilmiştir. Bu model koroid vaskülatür (EC, makrofajlar, perisitler) ve retinal pigment epitel (RPE) arasındaki etkileşimi içerir. Fare RPE/koroid/skleral eksplorasyonizole edilir ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membran ekstresi (BME) (gün 0) inkübe edilir. Orta her gün değiştirilir ve koroid filizlenme gün 6 sayısallaştırılır. Bireysel koroooid eksplant görüntüleri ters faz mikroskobu ile alınır ve filizlenme alanı bu laboratuvarda geliştirilen ImageJ yazılımına yarı otomatik makro eklentisi kullanılarak ölçülür. Bu tekrarlanabilir ex vivo koroidal filizlenme tsay potansiyel tedavi ve mikrovasküler hastalık araştırma yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak koroidal mikro damar çoğalması ile ilgili yolları değerlendirmek için bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Koroidal anjiyogenez disregülasyonu neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1ile ilişkilidir. Koroid retinapigment epitel (RPE) altında bulunan bir mikrovasküler yatak. Bu koroid azalmış kan akımı AMD ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir2. Vasküler endotel, RPE, makrofajlar, perisitler ve diğer hücreler arasındaki karmaşık ilişki doku homeostaz sorumludur3,4,5. Bu nedenle, korooidal mikroçevre modelleme bir tekrarlanabilir tsay neovasküler AMD çalışması için önemlidir.
Ex vivo anjiyogenez testleri ve in vitro endotel hücre kültürleri, yeni ilaçların test edilmesi ve patogenez çalışmaları için in vivo mikrovasküler davranış çalışmalarını tamamlayabilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri gibi endotel hücreleri (HRMECs), İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC), izole primer hayvan beyni veya retinal ECs genellikle oküler anjiyogenez araştırma için in vitro çalışmalarda kullanılır6,7,8. Özellikle HrMECs yaygın olarak in vitro koroidal nevaskülarozizasyon bir model olarak kullanılmıştır (CNV)9 endotel proliferasyonu, göç, tübüler oluşumu ve vasküler sızıntı değerlendirilerek müdahaleler6,10. Ancak, kültürdeki AK'ler, koroidde bulunan diğer hücre tipleri ile etkileşim eksikliği nedeniyle ve bu tahlillerde kullanılan çoğu EC koroidkaynaklı olmadığından CNV modeli olarak sınırlıdır. Fare koroidal ECs izole etmek ve kültür de korumak zordur.
Aort halkası tonu yaygın makro vasküler proliferasyon modeli olarak kullanılır. Aort eksperlerinden vasküler filizler ECs, perisitler ve makrofajlar11içerir. Aort halka sıyrık modelleri büyük damar anjiyogenez iyi12,13,14. Ancak, aort halkaları karakteristik koroidal mikrovasküler ortamdan yoksun bir makrovasküler doku olarak koroidal nevasaskülarizasyon bir model olarak sınırlamalar vardır, ve büyük damarlardan filizmikrovasküler patoloji dahil kılcal ağlardan filiz farklı olabilir. Son zamanlarda bir grup bir ex-vivo retinal assay15,16yayınladı. Retinal nevasküler hastalık için uygun olmasına rağmen, AMD'de görüldüğü gibi koroidal nevasaskülarizasyon için uygun değildir.
Fare RPE kullanılarak koroidal filizlenme tayini, koroid, ve skleral ekstre doku daha iyi model CNV için geliştirilmiştir. Doku kolayca fare (veya diğer türler) gözleri17izole edilebilir. Bu teşp, farmakolojik bileşiklerin pro- ve anti-anjiojen potansiyelinin tekrarlanabilir değerlendirilmesi ve genetiği değiştirilmiş fareler ve kontrollerden doku kullanarak koroidal nekolkülarizasyonda spesifik yolların rolünün değerlendirilmesisağlar 18. Bu koroidal filizlenme tsay birçok sonrakiyayınlardareferans olmuştur 9,10,18,19,20. Burada, bu tişin kullanımında yer alan yöntem gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (ARCH protokol numarası 19-04-3913R).
1. Hazırlık
- 5 mL penisilin/Streptomisin (10000 U/mL) ve 5 mL ve 10 mL ticari olarak mevcut takviyeleri 500 mL serumlu komple klasik ortama ekleyin. Aliquot 50 mL başlangıçta orta.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için herhangi bir ortamı stoğa geri döndürmeyin. - Buz üzerinde tam klasik orta bir aliquot koyun.
- Diseksiyon mikroskobu, forceps ve makas temizlemek için% 70 etanol kullanın.
- İki hücre kültürü yemekleri (10 cm), bir diseksiyon mikroskop, bir buz üzerinde hazırlayın; her çanak tam klasik orta 10 mL koyun.
2. Deneysel adımlar (Şekil 1)
- Kurban C57BL/6J fareler doğum sonrası etrafında (P) 20 75-100 mg/kg ketamin ve 7.5 -10 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjekte. Diseksiyon dan önce gözleri buz üzerinde tam klasik ortamda tutun.
- Bağ dokusu (kas ve yağ dokusu) ve göz optik sinir kaldırın.
- Kornea limbusuna 0,5 mm arka veya çevresi kesmek için mikro makas kullanın. Kornea / iris kompleksi, vitreus ve lens çıkarın.
- Optik sinir doğru kesme kenarına dik bir 1 mm kesi olun ve 1 mm genişliğinde bir çevre bandı kesti. Kompleksin merkezi ve çevresel bölgelerini ayırın. RPE/koroid/sklera kompleksinden retinayı soymak için forceps kullanın.
- Periferik koroid bandı buz üzerinde tam klasik ortamda tutun; diğer göz izole ve ikinci bir bant kesmek için işlemi tekrarlayın.
- Dairesel bandı 6 ~eşit kare parçaya (~1 mm x 1 mm) kesin.
NOT: Hiçbir kenara dokunmayın. - Üretim talimatı başına bazal membran ekstresini (BME) eritin. 24 kuyu doku kültürü plakasının her kuyunun ortasına 30 μL/kuyu BME ekleyin. BME damlacık kenarlarına dokunmadan plakanın altında bir konveks kubbe oluşturduğundan emin olun.
NOT: BME'yi bir buzdolabında bir gecede eritin. BME eritme sonra her zaman buz üzerinde olmalıdır. - BME ortasına doku yerleştirin.
NOT: Koroid eksplantDüzleştirmek etmeyin; genellikle, doku BME içinde genişletmek sağlar. Dokunun oryantasyonu (skleral tarafı yukarı veya aşağı) deneysel sonucu etkilemez. - Jelkatı izin vermek için 10 dakika boyunca 37 °C'de plaka kuluçka.
- Tam klasik orta /kuyu 500 μL ekleyin.
- Klasik ortamı her gün (500 μL) değiştirin. Koroid filizlenme mikroskop ile 3 gün sonra görülebilir.
NOT: Büyüme faktörü tedavisi için, 4 saat için doku açlıktan. Büyüme faktörü azaltılmış ortamda bir deneme bileşik seyreltmek (1:50 yerine 1:200 artırmak).
3.SWIFT-Korooid bilgisayarlı niceleme yöntemi17 (Şekil 2)
NOT: Büyüyen damarların kapsadığı alanı ölçmek için bilgisayarlı bir yöntem kullanılmıştır. ImageJ yazılımına bir makro eklentisi, nicelikselleştirmeden önce gereklidir (daha fazla ayrıntı için Ek Bilgiler'e bakın).
- ImageJ ile koroid filizlenen görüntüyü açın ve "Resim | Yazın| 8-bit" gri ölçekli.
- "Resim | | ayarlama Parlaklık/Kontrast (Ctrl/shift/C)" ve kontrastı optimize edin.
- Filizin merkezinde bulunan koroid dokuyu anahatlamak ve görüntüden çıkarmak için sihirli değnek işlevini kullanın (kısayol tuşu "F1")(Şekil 2A,B)kullanın.
NOT: Sihirli değnek tolerans oranını %20-30 olarak ayarlayın. - Ücretsiz seçim araçlarıyla resmin arka planını kaldırın(Şekil 2C). "Resim | | ayarlama Eşik (Ctrl/shift/T)". Mikrovasküler filizleri arka plana ve çevreye karşı tanımlamak için eşik işlevini kullanın (Şekil 2D).
- "F2" seçeneğini tıklayın ve bir özet görüntülenir. Seçili alanın görüntüsünü " Kaydet " düğmesine tıklayarakkaydedin. Gelecekteki başvuru için özgün resimle aynı klasöre kaydedin.
- Bir grup örnek ölçüldükten sonra, veri analizi için kaydedilen kopyayı kopyalayın.
NOT: Alanı (μm²) "Analiz | Ölçekçubukları olan görüntüleri kullanarak Ölçek'i ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Günde korooid filizlenme artışının karşılaştırılması
Biz sklera ile koroid diseksiyon, BME gömülü ve 6 gün boyunca kültürlü(Şekil 1). C57BL/6J farelerinde 3.günden 6.güne kadar filizlenen korooit mikroskopla incelendi ve ImageJ'de yarı otomatik bir niceleme yöntemi ile SWIFT-Choroid ölçüldü. Temsili bir durumda, koroidal filizlenme alanı (ekstreğe kadar uzanan damarlar, eksplantın kendisi hariç) Gün 3'te 0,38 mm2 (Şekil 3A),Gün 4'te 1,47 mm2 (Şekil 3B), 5,62 mm2 Gün 5(Şekil 3C) ve 10,09 mm2 Gün 6(Şekil 3D)idi.
Serbest yağ asidi reseptörü (FFAR)4 baskılanması koroidal nevaskülarizasyon ex vivo şiddetlendirir.
FFAR4 kaybının (G -protein ile birleşen reseptör 120 olarak da bilinir) koroidal vasküler filizlenme üzerindeki etkileri koroid filizlenme tetkik18kullanılarak değerlendirildi. Koroid, RPE ve sklera kompleksi Ffar4 knock out (-/-) ve Ffar4+/+ farelerden kesilip yukarıda açıklandığı gibi kültürlüdür. Ffar4-/- artmış koroidal vasküler büyüme de filizlenme alanı Ffar4 + / + gün 6 (p = 0.004)(Şekil 4A,B)ile karşılaştırıldığında. FFAR4 agonistinin (1 μM) tedavisi, 6.
Şekil 1: Koroid filizlenme teşrinini gösteren şematik illüstrasyon.
Gözler ilk olarak enükleated ve limbus yaklaşık 0.5 mm posterior çevresel olarak kesildi. Kornea, iris, lens ve vitreus çıkarıldı. Sonra göz kabının kenarından optik sinire doğru 1 mm'lik bir kesik kesildi. Daha sonra bir bant kesme kenarına yaklaşık 1.0 mm arka çevrekesildi ve bant ve kompleksin çevre bölgeleri ayrıldı. Bant yaklaşık 1 mm x 1 mm parçalar halinde kesilmiş ve BME'ye gömülmüş. Daha sonra bir mikroskop kullanılarak, koroidin mikrovasküler filizleri görselleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SWIFT-Korooid bilgisayarlı nicelleştirme yöntemi.
(A,B) Büyü değnek fonksiyonu koroid doku anahat için kullanılan (beyaz ok) filiz merkezinde ve dijital olarak kaldırıldı (Kısayol tuşu "F1"). (C, D) Resmin arka planı ücretsiz seçim araçları (siyah ok) ile kaldırıldı. Mikrovasküler filizler daha sonra arka plan ve çevre karşı eşik fonksiyonu kullanılarak tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare periferik korooid filizlenme.
(A-D) C57BL/6J fare ile korooid filizlerinin temsili görüntüleri ve filizlerin alanını ölçen SWIFT-Koroid yönteminin gösterileri. Koroidal filizlenme alanı Gün 3(A),1,47 mm2 Gün 4(B),5,62 mm2 Gün 5(C)ve 10,09 mm2 Gün 6(D)idi. Ölçek çubuğu; 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Serbest yağ asidi reseptörü (FFAR) 4 baskılayıcı koroidal nevaskülarizasyonu alevlendirir.
(A) Serbest yağ asidi reseptöründen koroid ile filizlenen teşpin temsili görüntüleri(Ffar)4+/+ Ffar4 knock out (--) fareler ile karşılaştırıldığında: üst görüntü Ffar4 kromoid gösterir +/+ düşük görüntü Ffar4-/- koroid gösterir. (B)Ffar4-/- Ffar4 +/+ farelere göre koroooid filizlenmede artış gösterdi (n = 6-8). (C) Korooid filizlenmenin temsili görüntüleri: üst görüntü araç tedavisini (kontrolü) gösterir; düşük görüntü FFAR4 agonist tedavi gösterir. (D) FFAR4 agonist baskılı korooidal filizlenme kontrol (n = 10-12) ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubukları = 500 μm. Veriler Öğrencinin t-testi ile analiz edildi ve ortalama ± SE. *p < 0.05 olarak ifade edildi; **p < 0.01. Bu rakam Tomita ve ark.18'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Koro fifiliz ilik programı için eklentiler ve kısayollar nasıl oluşturulur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koroidal filizlenme tonu neovasküler AMD9,10,18,19,20araştırma yardımcıları . Koroid eksponer fareler yanı sıra sıçan ve insanlar17,21izole edilebilir. Koroid ekstreğe EC, makrofajlar ve perisitler17içerir. Bu tsurkta koroidal EC'ler ve RPE hücreleri gibi komşu hücreler arasındaki etkileşim, koroidal vasküler büyüme dahil mekanizmaların açıklığa kavuşturulmeye yardımcı17. Ayrıca, bu tekrarlanabilir ve yarı otomatik değerlendirme yöntemi17.
Ex vivo koroidal doku ilk yayınlanan çalışma DR ve AMD22,23,24,25tedavi potansiyeli ile farmakolojik müdahaleleri test etmek için izole koroid kullanılır . Titre, gözlemciler arası değişkenliğe maruz kalabilecek filizlenen damarların sayısını ve uzunluğunu saydı. Buna karşılık, burada açıklanan nicelleştirme yöntemi17standartlaştırılmıştır. Mikrovasküler koroid anjiyogenezin bu teşpininteraktif ortak hücreleri ve hücre dışı matriks içerir. Kültürdeki AB'ler, RPE gibi diğer hücrelerle etkileşimkaybına bağlı olabilecek vasküler tüpler26'yı oluşturma yeteneği gibi fizyolojik özelliklerinin çoğunu kaybedebilirler. Bu nedenle, AT in vitro kültürlerkoroiyal nevasaskülarizasyon tüm yönlerini yansıtmayabilir. Aort halkası tsurel büyük damar endotel hücreleri ve interaktif hücreler büyük kaplardan filizlenme değerlendirmek için içerir. Ama büyük damar filizi doğru koroidal mikrovasküler hastalık27yansıtmayabilir. Koroidal filizlenme tsurukla koroidal mikrovasküler yanıtların daha yakın bir temsilidir.
Önemli uyarılar var. İlk olarak, periferik koroid kompleks explant filizleri daha tutarlı ve merkezi bölümlerden explants çok daha hızlı büyümek17. İkinci olarak, rpe ile koroid filizrpe17olmadan çok daha hızlı büyümek çünkü koroid RPE kaldırılmadı. Bir ilacın sadece koroid üzerindeki etkisini anlamak için RPE'siz bir tetki kılabilir. Son olarak, sihirli değnek fonksiyonu kullanarak koroid doku ve filizlenme alanının görüntü özetleyen, bazen yüksek arka plan gürültü nedeniyle koroid filizlenme alanı izlemek zordur. Görüntüler arasında farklılık olabilir. Bu nedenle, tutarlılık için, dijital şekil 2'degörüldüğü gibi koroid ve arka plan arasında yeterli kontrast oluşturmak önemlidir.
Özetle, ex vivo koroid filizlenme tsay karakterize edilmiş ve yarı otomatik. Bu yöntem, AMD araştırmaları için deneysel bir araç sağlar. Bu tsay potansiyel tedaviler olarak bileşikleri taramak veya yabani tip ve genetiği değiştirilmiş fare dokusu kullanarak koroidal mikro damarların çoğalmasında rol oynayan yolları değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların mali açıklamaları yok. Bilgisayarlı yöntem yazarlar aracılığıyla akademik kurumlara ücretsiz olarak sunulmaktadır.
Acknowledgments
Çalışma Manpei Suzuki Diyabetvakfı (YT), Boston Çocuk Hastanesi OFD/BTREC/CTREC Fakülte Kariyer Geliştirme Hibesi, Boston Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı, BCH Pilot Ödülü, BCH Manton Center Bursu, ve Little Zaffe Foundation (ZF), Alman Araştırma Vakfı (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye (LEH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
