Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell
Summary
Die Stammzelltherapie hat sich als effiziente Strategie zur Reparatur von verletztem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt herauskristallisiert. Wir bieten eine optimale In-vivo-Anwendung für die Stammzelltransplantation mit gelatinenhydrogelen, die enzymatisch vernetzt werden können.
Abstract
Eines der Hauptprobleme, mit denen aktuelle Herzstammzelltherapien zur Vorbeugung von Herzinsuffizienz nach dem Infarkt konfrontiert sind, ist die niedrige Retentions- und Überlebensrate transplantierter Zellen innerhalb des verletzten Myokards, wodurch ihre therapeutische Wirksamkeit eingeschränkt wird. In jüngster Zeit hat der Einsatz von Gerüstbiomaterialien Aufmerksamkeit für die Verbesserung und Maximierung der Stammzelltherapie gewonnen. Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache und einfache Technik zur Transplantation von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark unter Verwendung injizierbarer Hydroxyphenylpropionsäure (GH)-Hydrogele einzuführen; Die Hydrogele sind als Zellabgabeplattform für Herzgewebe-Engineering-Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, in situ vernetzt zu sein, und hoher Biokompatibilität günstig. Wir präsentieren eine einfache Methode zur Herstellung von MSC-ladenden GH-Hydrogelen (MSC/Hydrogels) und bewerten deren Überleben und Proliferation in dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur. Darüber hinaus zeigen wir eine Technik zur intramyokardialen Transplantation von MSC/Hydrogelen bei Mäusen, die einen chirurgischen Eingriff beschreibt, um einen Myokardinfarkt (MI) über links anterior absteigende (LAD) koronare Arterienligation und anschließende MSC/Hydrogel-Transplantation zu induzieren.
Introduction
Die Herzstammzelltherapie hat sich als möglicher Ansatz für die Myokardreparatur und -regeneration1,2herauskristallisiert. Trotz der jüngsten positiven Ergebnisse in Tiermodellen und klinischen Studien ist die Anwendung einer Stammzelltherapie zur Myokardreparatur aufgrund der geringen Retention und des schlechten Überlebens der injizierten Zellen an den infarktierten Herzgeweben3,4begrenzt. Als Ergebnis wurde der Einsatz von zellbasierter Gewebetechnik, einschließlich injizierbarer Biomaterialien5, Herzpflaster6und Zellblätter7, intensiv untersucht, um die Zellretention und -integration innerhalb des Wirtsmyokards zu verbessern.
Unter den verschiedenen möglichen Ansätzen zur biotechnischen Herzgewebereparatur sind injizierbare Hydrogele in Kombination mit geeigneten Zelltypen, wie mesenchymale Stammzellen (MSCs), embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), eine attraktive Option, um Zellen effektiv in die Myokardregionen8,9zu liefern. Gelatine, ein bekanntes natürliches Polymer, kann aufgrund seiner großen Biokompatibilität, seiner beträchtlichen biologischen Abbaubarkeit und der reduzierten Immunogenität im Vergleich zu einer Vielzahl von Biomaterialien, die in biomedizinischen Anwendungen verwendet werden, als injizierbare Matrix verwendet werden. Obwohl gelatinebasierte injizierbare Plattformen ein großes Potenzial haben, bleibt ihre Anwendbarkeit in vivo aufgrund ihrer geringen mechanischen Steifigkeit und leichten Abbaubarkeit in der physiologischen Umgebung begrenzt.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein neuartiges und einfaches Design von gelatinebasierten Hydrogelen, die aus Hydroxyphenylpropionsäure bestehen, für In-vivo-Anwendungen vorgeschlagen. Gelatine-Hydroxyphenylpropionsäure (GH) Konjugate können in Gegenwart eines Enzyms, Der Meerrettichperoxidase (HRP), in situ vernetzt werden und anschließend verschiedene Medikamente, Biomoleküle oder Zellen innerhalb des Hydrogels verkapseln, was auf ein großes Potenzial in gewebetechnischen Anwendungen10,11,12,13,14hindeutet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die therapeutische Wirkung von GH-Hydrogelen untersucht, die gekapselte MSCs enthalten, und ihre Verwendung bei erfolgreicher Herzreparatur und -regeneration nach MI in einem murinen Modell15nachgewiesen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Technik für die Verkapselung und in vitro dreidimensionale (3D) Proliferation von MSCs in GH-Hydrogelen. Wir führen auch ein chirurgisches Verfahren ein, das entwickelt wurde, um ein murines MI-Modell über koronare Arterienligation und intramyokardiale Transplantation von MSC-ladenden GH-Hydrogelen in das infektiierte Herz zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injizierbare GH-Hydrogele haben aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene therapeutische Wirkstoffe in situ homogen zu integrieren, ein großes Potenzial für In-vivo-Anwendungen. Darüber hinaus können ihre physikalischen und biochemischen Eigenschaften aufgrund krankheitsabhängiger Anforderungen leicht manipuliert werden. In dieser Hinsicht wurden injizierbare Hydrogele vorgeschlagen, um die großen Einschränkungen in der aktuellen Herzstammzelltherapie anzugehen, die durch schlechtes Überleben und Zellretention (d. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird durch das Basic Science Research Program von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Bildungsministerium (NRF-2018R1D1A1A02049346) gefördert wird.
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
Referências
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