Trapianto intramiocardico di idrogel iniettabili a carico MSC dopo infarto del miocardio in un modello murino
Summary
La terapia a base di cellule staminali è emersa come una strategia efficiente per riparare i tessuti cardiaci feriti dopo l’infarto del miocardio. Forniamo un’applicazione in vivo ottimale per il trapianto di cellule staminali utilizzando idrogel di gelatina che possono essere enzimaticamente incrociati.
Abstract
Uno dei principali problemi che devono affrontare le attuali terapie con cellule staminali cardiache per prevenire l’insufficienza cardiaca postinfarct è il basso tasso di ritenzione e sopravvivenza delle cellule trapiantate all’interno del miocardio ferito, limitandone l’efficacia terapeutica. Recentemente, l’uso di biomateriali impalcatura ha attirato l’attenzione per migliorare e massimizzare la terapia con cellule staminali. L’obiettivo di questo protocollo è introdurre una tecnica semplice e diretta per trapiantare le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (MSC) utilizzando idrogel di acido propionico idrossifenile iniettabile (GH); gli idrogel sono favorevoli come piattaforma di somministrazione cellulare per applicazioni di ingegneria dei tessuti cardiaci a causa della loro capacità di essere collegati in situ incrociati e dell’elevata biocompatibilità. Presentiamo un metodo semplice per fabbricare idrogel GH a caricamento MSC (MSC/idrogel) e valutarne la sopravvivenza e la proliferazione in coltura tridimensionale (3D) in vitro. Inoltre, dimostriamo una tecnica per il trapianto intramiocardico di MSC / idrogel nei topi, descrivendo una procedura chirurgica per indurre l’infarto miocardico (MI) tramite la legatura coronarica discendente anteriore sinistro (LAD) e il successivo trapianto MSC / idrogels.
Introduction
La terapia con cellule staminali cardiache è emersa come un potenziale approccio per la riparazione e la rigenerazione delmiocardio 1,2. Nonostante i recenti risultati positivi nei modelli animali e negli studi clinici, l’applicazione della terapia a base di cellule staminali per la riparazione del miocardio è limitata a causa della bassa ritenzione e della scarsa sopravvivenza delle cellule iniettate nei tessuti cardiaci infarti3,4. Di conseguenza, l’uso dell’ingegneria tissutale a base cellulare, compresi i biomateriali iniettabili5,le chiazze cardiache6e ifogli cellulari 7,è stato intensamente studiato per migliorare la ritenzione cellulare e l’integrazione all’interno del miocardio ospite.
Tra i vari approcci potenziali alla riparazione del tessuto cardiaco bioingegnerato, gli idrogel iniettabili combinati con tipi di cellule appropriati, come le cellule staminali mesenchimali (MCC), le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC), sono un’opzione interessante per fornire efficacemente le cellule nelle regioni del miocardio8,9. La gelatina, un noto polimero naturale, può essere utilizzata come matrice iniettabile grazie alla sua grande biocompatibilità, alla notevole biodegradabilità e alla ridotta immunogenicità rispetto a una vasta gamma di biomateriali utilizzati in applicazioni biomediche. Sebbene le piattaforme iniettabili a base di gelatina abbiano un grande potenziale, la loro applicabilità in vivo rimane limitata in base alla loro bassa rigidità meccanica e alla facile degradabilità nell’ambiente fisiologico.
Per superare questi limiti, è stato proposto un nuovo e semplice design di idrogel a base di gelatina costituiti da acido propionico idrossifenile per applicazioni in vivo. I coniugati gelatino-idrossifenil propionico (GH) possono essere reticolati in situ in presenza di un enzima, la perossidasi di rafano (HRP), e successivamente incapsulare vari farmaci, biomolecole o cellule all’interno dell’idrogel, suggerendo un grande potenziale nelle applicazioni di ingegneriatissutale 10,11,12,13,14. Inoltre, abbiamo recentemente studiato gli effetti terapeutici degli idrogel gh contenenti MSC incapsulati e dimostrato il loro uso nella riparazione e rigenerazione cardiaca di successo dopo l’MI in un modello murino15. In questo protocollo, descriviamo una semplice tecnica per l’incapsulamento e la proliferazione tridimensionale in vitro (3D) dei CCI all’interno degli idrogel GH. Introduciamo anche una procedura chirurgica progettata per generare un modello MI murino attraverso la legatura dell’arteria coronarica e il trapianto intramiocardico di idrogel GH a caricamento MSC nel cuore infarto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli idrogel GH iniettabili hanno un grande potenziale per applicazioni in vivo grazie alla loro capacità di incorporare omogeneamente diversi agenti terapeutici in situ. Inoltre, le loro proprietà fisiche e biochimiche possono essere facilmente manipolate in base a requisiti dipendenti dalla malattia. A questo proposito, sono stati proposti idrogel iniettabili per affrontare le principali limitazioni dell’attuale terapia con cellule staminali cardiache ostacolate dalla scarsa sopravvivenza e ritenzione cellulare (cioè…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è supportata dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero dell’Istruzione (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
Referências
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