マウスモデルにおける心筋梗塞後のMSC負荷注入性ヒドロゲルの筋内移植
1Cardiovascular Research Institute for Intractable Disease, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 2Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 3Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Uijeongbu St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea
Summary
幹細胞ベースの治療は、心筋梗塞後に負傷した心臓組織を修復するための効率的な戦略として浮上している。酵素的に架橋できるゼラチンハイドロゲルを用いた幹細胞移植に最適なインビボアプリケーションを提供します。
Abstract
梗塞後の心不全を予防するための現在の心臓幹細胞療法が直面している主要な問題の1つは、負傷した心筋内の移植細胞の低い保持率と生存率であり、治療効果を制限する。近年、スキャフォールディング生体材料の使用は、幹細胞治療の改善と最大化に注目されています。このプロトコルの目的は、注射用ヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)ヒドロゲルを使用して骨髄由来間葉系幹細胞(MCC)を移植するための簡単で簡単な技術を導入することです。ヒドロゲルは、その場で架橋され、高い生体適合性を持つ能力のために、心臓組織工学アプリケーション用の細胞送達プラットフォームとして好ましい。MSC負荷GHヒドロゲル(MSC/ヒドロゲル)を製造し、その生存と増殖を3次元(3D)インビトロ培養で評価する簡単な方法を紹介します。また、マウスにおけるMSC/ヒドロゲルの心筋内移植の手法を示し、左前下降(LAD)冠動脈結紮術とその後のMSC/ヒドロゲル移植を介して心筋梗塞(MI)を誘導する外科的処置を説明する。
Introduction
心臓幹細胞療法は、心筋修復および再生1,2の潜在的アプローチとして出現した。動物モデルおよび臨床試験における最近の肯定的な結果にもかかわらず、心筋修復のための幹細胞ベース療法の適用は、梗塞した心臓組織3、4における注入された細胞の低い保持および生存不良のために制限される。その結果、細胞系組織工学の使用は、注射可能な生体材料5、心臓パッチ6、および細胞シート7を含む、宿主心筋内の細胞の保持および統合を改善するために集中的に研究されてきた。
生体工学的心臓組織修復に対する様々な潜在的アプローチの中で、間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹細胞(ESC)、および人工多能性幹細胞(iPSC)などの適切な細胞タイプと組み合わせた注射可能なヒドロゲルは、心筋領域8,9に細胞を効果的に送達するための魅力的な選択肢である。ゼラチンは、よく知られている天然ポリマーであり、生物医学用途で使用される幅広い生体材料と比較して、その優れた生体適合性、かなりの生分解性、および免疫原性の低下により、注射可能なマトリックスとして使用することができます。ゼラチンベースの注入プラットフォームは大きな可能性を秘めていますが、生体内での適用性は、低い機械的剛性と生理学的環境における容易な劣化性に基づいて制限されたままです。
これらの制限を克服するために、インビボ用途に対してヒドロキシフェニルプロピオン酸からなるゼラチン系ヒドロゲルの新規かつシンプルな設計が提案されている。ゼラチンヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)コンジュゲートは、酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の存在下でその時に架橋することができ、その後、様々な薬物、生体分子、またはヒドロゲル内の細胞を封入し、組織工学アプリケーション10、11、12、13、14に大きな可能性を示唆している。さらに、我々は最近、カプセル化されたMSCを含むGHヒドロゲルの治療効果を調査し、マウスモデル15におけるMI後の心臓修復および再生に成功した心臓修復および再生におけるそれらの使用を実証した。本プロトコルでは、GHヒドロゲル内のMCのカプセル化およびインビトロ3次元(3D)増殖に関する簡単な手法について述べた。また、梗塞した心臓へのMSC負荷GHヒドロゲルの冠動脈結紮および筋膜内移植を介してマウスMIモデルを生成するように設計された外科的処置を導入する。
Protocol
すべての動物研究手順は、実験動物福祉法、実験動物のケアと使用のためのガイド、および韓国カトリック大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供するげっ歯類実験のガイドラインと方針に従って提供されました。 1. MSCおよび注射ゼラチンハイドロゲルの調製 37°Cと5%CO2で100mm培養皿で培養MSC.CSの成長が80%の合流に達したら、DPBSで皿を2回?…
Representative Results
梗塞心筋にMCを効果的に送達するために、 図1 に記載されたシンチクロスリンク可能なヒドロゲル中のMSC負荷をこのプロトコルで使用した。インビボ移植の前に、GHヒドロゲル中のMCの増殖および生存は、3Dインビトロ生きている/死細胞染色アッセイ(生:緑;死んだ:赤)によって確認された。 図2に示すように、代表的な画像は十分なMSC増殖を示し、GH?…
Discussion
注射可能なGHヒドロゲルは、多様な治療薬をその一体的にその中に組み込む能力のために、インビボアプリケーションに大きな可能性を秘めています。さらに、それらの物理的および生化学的特性は、疾患に依存する要件に基づいて容易に操作することができる。この点で、注射ヒドロゲルは、負傷した心臓19,20における生存不良および細胞保持(す…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、文部省が出資する韓国国立研究財団(NRF)を通じて基礎科学研究プログラム(NRF-2018R1D1A1A0202049346)の支援を受けています。
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
Referências
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Keywords:
Mesenchymal Stem CellsMSCsInjectable HydrogelsIntramyocardial TransplantationMyocardial InfarctionMurine ModelCell RetentionCell SurvivalGrowth FactorsGenetic MaterialsDrugsIn Vitro ExperimentIn Vivo ExperimentCell CultureCell SuspensionTrypsinTrypan BlueCell CountingGH Conjugate SolutionHydrogen PeroxideDual Syringe
Citar este artigo
Kim, C. W., Kim, C. J., Park, E., Lee, E., Seong, E., Chang, K. Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model. J. Vis. Exp. (163), e61752, doi:10.3791/61752 (2020).