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आरएनए विश्लेषण और मैक्रोफेज फेनोटाइपिंग के लिए उपयुक्त मानव आंत वसा ऊतक से व्यवहार्य एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश का अलगाव

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61884
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 2, 7, 8
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Summary

यह प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में मानव आंत के वसा से व्यवहार्य एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश-एसवीएफ कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक कुशल कोलेजनेज पाचन विधि प्रदान करता है, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए कई झिल्ली-बाध्य मार्करों के धुंधला के माध्यम से एडिपोसाइट्स और एसवीएफ-मैक्रोफेज के फेनोटाइपिंग से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के लिए कार्यप्रणाली शामिल है।

Abstract

आंत का वसा ऊतक (वैट) एक सक्रिय चयापचय अंग है जो मुख्य रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) कोशिकाओं से बना होता है, जो विभिन्न बायोएक्टिव अणुओं को छोड़ते हैं जो चयापचय, हार्मोनल और प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं; वर्तमान में, यह स्पष्ट नहीं है कि इन प्रक्रियाओं को वसा ऊतक के भीतर कैसे विनियमित किया जाता है। इसलिए, वसा ऊतक के पैथोफिज़ियोलॉजी में प्रत्येक कोशिका आबादी के योगदान का मूल्यांकन करने वाले तरीकों का विकास महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल अलगाव चरणों का वर्णन करता है और एक ही प्रक्रिया में मानव वैट बायोप्सी से व्यवहार्य परिपक्व एडिपोसाइट्स और एसवीएफ के कुशल अलगाव के लिए आवश्यक समस्या निवारण दिशानिर्देश प्रदान करता है, एक कोलेजनेज एंजाइमेटिक पाचन तकनीक का उपयोग करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी मैक्रोफेज सबसेट की पहचान करने और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए परिपक्व adipocyte शाही सेना अलगाव प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित है, जो इन सेल आबादी के बीच बातचीत विदारक अध्ययन प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. संक्षेप में, वैट बायोप्सी को धोया जाता है, यंत्रवत् कीमा बनाया जाता है, और एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए पचाया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, परिपक्व एडिपोसाइट्स को एसवीएफ गोली से प्लवनशीलता द्वारा अलग किया जाता है। शाही सेना निष्कर्षण प्रोटोकॉल बहाव अभिव्यक्ति assays के लिए adipocytes से कुल शाही सेना (miRNAs सहित) की एक उच्च उपज सुनिश्चित करता है. इसके साथ ही, एसवीएफ कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से मैक्रोफेज सबसेट (समर्थक और विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप) को चिह्नित करने के लिए किया जाता है।

Introduction

सफेद वसा ऊतक न केवल वसा कोशिकाओं या एडिपोसाइट्स से बना होता है, बल्कि एक गैर-वसा कोशिका अंश भी होता है जिसे स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के रूप में जाना जाता है, जिसमें मैक्रोफेज में एक विषम कोशिका आबादी होती है, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) के रूप में, और ईोसिनोफिल, प्रीडिपोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स, संवहनी और संयोजी ऊतक 1,2 से घिरे होते हैं. वसा ऊतक (एटी) अब एक अंग है कि एडीपोकिन्स, साइटोकिन्स, और microRNAs के माध्यम से चयापचय और सूजन से संबंधित शारीरिक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है और ऊतक में विभिन्न कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है, autocrine, paracrine, और अंतःस्रावी प्रभाव 3,4 के साथ. मनुष्यों में, सफेद वसा ऊतक चमड़े के नीचे वसा ऊतक (सैट) और आंत वसा ऊतक (वैट), उन 2,5 के बीच महत्वपूर्ण शारीरिक शारीरिक, आणविक, सेलुलर और शारीरिक अंतर के साथ शामिल हैं. सैट मानव एटी के 80% तक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि वैट पेट की गुहा के भीतर स्थित है, मुख्य रूप से मेसेंटरी और ओमेंटम में, चयापचय रूप सेअधिक सक्रिय 6. इसके अलावा, वैट एक अंतःस्रावी अंग है जो शरीर के वजन, इंसुलिन संवेदनशीलता, लिपिड चयापचय और सूजन पर पर्याप्त प्रभाव के साथ मध्यस्थों को गुप्त करता है। नतीजतन, वैट संचय पेट मोटापा और मोटापे से संबंधित बीमारियों जैसे टाइप -2 मधुमेह, चयापचय सिंड्रोम, उच्च रक्तचाप, और हृदय रोग के जोखिम की ओर जाता है, जो मोटापे से जुड़ेमृत्यु दर 6,7,8,9के बेहतर भविष्यवक्ता का प्रतिनिधित्व करता है।

होमोस्टैटिक स्थितियों में, एडिपोसाइट्स, मैक्रोफेज और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों के स्राव के माध्यम से वैट चयापचय को बनाए रखने के लिए सहयोग करती हैं10. हालांकि, अत्यधिक वैट विस्तार सक्रिय टी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और मैक्रोफेज की भर्ती को बढ़ावा देता है। वास्तव में, दुबला वैट में, मैक्रोफेज का अनुपात 5% है, जबकि यह अनुपात मोटापे में 50% तक बढ़ जाता है, मैक्रोफेज ध्रुवीकरण विरोधी भड़काऊ से प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप तक, एक पुरानी भड़काऊ वातावरण10,11उत्पन्न करता है।

मोटापा महामारी का एक परिणाम के रूप में, रिपोर्ट की एक आश्चर्यजनक संख्या विभिन्न वैट अनुसंधान विषयों को संबोधित उत्पन्न हुई है, एडिपोसाइट जीव विज्ञान सहित, epigenetics, सूजन, अंतःस्रावी गुण, और बाह्य पुटिकाओं के रूप में उभरते क्षेत्रों,दूसरों के बीच 8,10,12,13. हालांकि, वैट पर्यावरण adipocytes और निवासी या आने मैक्रोफेज के बीच crossstock द्वारा परिभाषित किया गया है, हालांकि सबसे अध्ययन केवल एक सेल आबादी पर ध्यान केंद्रित किया है, और वैट और उनके रोगजनक परिणामों11,14 में इन कोशिकाओं की बातचीत के बारे में दुर्लभ जानकारी है. इसके अलावा, एटी में एडिपोसाइट-मैक्रोफेज इंटरप्ले को संबोधित करने वाले मूल्यवान अध्ययन सेल लाइनों का उपयोग करके किए गए थे, जिसमें विवो प्राइमिंग स्थितियों 11,14,15की कमी थी। वैट में इन कोशिकाओं की बातचीत या विशेष योगदान को विच्छेदन करने के लिए एक उपयुक्त रणनीति को एक ही वसा बायोप्सी से दोनों सेल प्रकारों के अलगाव की आवश्यकता होती है ताकि इन विट्रो परख में प्रदर्शन किया जा सके जो वैट चयापचय को नियंत्रित करने वाले विवो गुणों में यथासंभव दर्पण करता है।

हालांकि एटी को तोड़ने के लिए यांत्रिक बलों पर आधारित गैर-एंजाइमेटिक पृथक्करण विधियां न्यूनतम हेरफेर सुनिश्चित करती हैं, इन विधियों का उपयोग नहीं किया जा सकता है यदि उद्देश्य एसवीएफ कोशिकाओं का अध्ययन करना है, क्योंकि उनके पास एंजाइमी तरीकों की तुलना में सेल रिकवरी और कम सेल व्यवहार्यता में कम दक्षता है, और ऊतक की एक बड़ी मात्रा16,17 की आवश्यकता है. कोलेजन का उपयोग एंजाइमी पाचन एक सौम्य विधि है जो डब्ल्यूएटी18 जैसे रेशेदार ऊतकों के कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के पर्याप्त पाचन की अनुमति देता है और अक्सर इसका उपयोग तब किया जाता है जब ट्रिप्सिन अप्रभावी या हानिकारकहोता है 19. प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में मानव वैट बायोप्सी से व्यवहार्य परिपक्व आदिपोसाइट्स और एसवीएफ कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए मौलिक समस्या निवारण दिशानिर्देश प्रदान करता है, एक कोलेजनेज एंजाइमेटिक पाचन तकनीक का उपयोग करके, उच्च पैदावार (मात्रा, शुद्धता और अखंडता) सुनिश्चित करने के लिए जानकारी देता है। इसके साथ ही, प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री20 द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए कई झिल्ली-बाध्य मार्करों के धुंधला के माध्यम से एसवीएफ कोशिकाओं से मैक्रोफेज सबसेट की पहचान करने के लिए अनुकूलित है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को इंस्टीट्यूटो नैशनल डी पेरिनाटोलोगिया (212250-3210-21002-06-15) के आईआरबी द्वारा अनुमोदित किया गया था। भागीदारी स्वैच्छिक थी, और सभी नामांकित महिलाओं ने सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए।

1. आंत का वसा ऊतक संग्रह

  1. श्रम के बिना अवधि में सिंगलटन गर्भधारण के साथ स्वस्थ वयस्क महिलाओं से सिजेरियन सेक्शन के दौरान आंशिक ओमेंटेक्टोमी के माध्यम से वैट बायोप्सी प्राप्त करें।
  2. गर्भाशय बंद होने और हेमोस्टेसिस के बाद, अधिक से अधिक ओमेंटम की पहचान करने के लिए आगे बढ़ें और इसे गीले सेक पर बढ़ाएं। एटी एक्सपोज्ड वैट है।
  3. सबसे बड़ी रक्त वाहिका का पता लगाएँ और अधिक से अधिक ओमेंटम बेस पर 7 x 5 सेमी की एक काल्पनिक रेखा का पता लगाएं।
  4. एक अवशिष्ट क्षेत्र की पहचान करें और वैट के बाहरी पक्ष ड्रिल करने के लिए केली संदंश का उपयोग करें।
  5. क्षेत्र में समीपस्थ और बाहर का पक्ष जकड़ना करने के लिए Ochsner संदंश का उपयोग करें जहां वैट drilled था और ऊतक में कटौती करने के लिए Metzenbaum कैंची का उपयोग करें.
  6. काले रेशम नंबर 1 के साथ अधिक से अधिक ओमेंटम बांधें।
  7. Ochsner संदंश निकालें और हेमोस्टेसिस का मूल्यांकन.
  8. वैट बायोप्सी को एक बाँझ कंटेनर में रखें और इसे तुरंत प्रयोगशाला में ले जाएं।

2. आंत के वसा ऊतक का एंजाइमेटिक पाचन और परिपक्व एडिपोसाइट्स और स्ट्रोमल संवहनी अंश कोशिकाओं का अलगाव

  1. वैट बायोप्सी का वजन करें और 1x पीबीएस पीएच 7.4 के साथ कुल्ला।
  2. वैट के 4 ग्राम काटें और एक विच्छेदन ट्रे में छोटे टुकड़ों में ऊतक कीमा करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  3. कीमा बनाया हुआ वैट को एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, पीबीएस के 20 एमएल जोड़ें, और लाल रक्त कोशिकाओं की अधिकता को हटाने के लिए धीरे से हिलाएं।
  4. पीबीएस त्यागें और प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  5. वैट को एक नई बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और पाचन समाधान के 25 एमएल (पीबीएस में 0.25% कोलेजनेज प्रकार द्वितीय, 5 मिमी ग्लूकोज, 1.5% एल्ब्यूमिन) जोड़ें।
  6. 125 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  7. एक नई बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में धुंध की तीन परतों के माध्यम से पचा ऊतक फ़िल्टर.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  9. दो चरण प्राप्त होते हैं, एक ऊपरी चरण जो परिपक्व एडिपोसाइट्स से मेल खाता है, जबकि एसएफवी कोशिकाएं गोली में रहती हैं। धीरे एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर एक नया बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में परिपक्व adipocytes हस्तांतरण.
  10. ठंड पीबीएस के 20 एमएल जोड़ें, धीरे से हिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  11. पीबीएस त्यागें और प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  12. परिपक्व आदिपोसाइट्स को 1.5 एमएल डीनेज-आरएनएसई मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में धीरे से स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरण विंदुक का उपयोग करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और एक P200 माइक्रोपिपेट का उपयोग कर अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें। यदि आवश्यक हो तो इस चरण को दोहराएं।
  14. धीरे-धीरे परिपक्व एडिपोसाइट निलंबन के 300 माइक्रोन को 1.5 एमएल डीनेज-आरएनएसई मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। आरएनए निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर परिपक्व आदिपोसाइट्स स्टोर करें।
    नोट: एडिपोसाइट्स एक गोली नहीं बनाते हैं।
  15. एक बार आदिपोसाइट्स अलग हो जाते हैं (चरण 2.9), एक हस्तांतरण विंदुक के साथ पाचन समाधान के अधिकांश महाप्राण करते हैं, ट्यूब के तल पर एसवीएफ गोली रखते हुए।
  16. एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एसवीएफ कोशिकाओं के साथ गोली स्थानांतरण.
  17. धीरे सेल गोली धो लें, ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा ठंड 1x पीबीएस के 20 एमएल में पुनरुत्थान.
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और तेजी से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  19. चरण 2.17 और 2.18 दोहराकर एक दूसरे धोने प्रदर्शन.
  20. एसवीएफ गोली में कमरे के तापमान (आरटी) के बराबर लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 5 एमएल जोड़ें और बार-बार पाइपिंग द्वारा निलंबित करें। भंवर मत करो।
  21. आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 800 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र। ध्यान से एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटा दें और ठीक से निपटान.
  22. लाइसिस बफर को बेअसर करने के लिए, ठंड 1x पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और धीरे से सेल गोली अलग होने तक मिलाएं।
  23. एसवीएफ गोली प्राप्त करने और पीबीएस को त्यागने के लिए 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। ट्यूब के तल पर एक सफेद गोली दिखाई देनी चाहिए।
  24. आरटी पर 1x पीबीएस के 5 एमएल में कोशिकाओं को बार-बार पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें और धुंध की तीन परतों के माध्यम से एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर किया जाए। इसके बाद, इन कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मैक्रोफेज उप-जनसंख्या लक्षण वर्णन के लिए किया जाएगा।

3. परिपक्व आदिपोसाइट्स से आरएनए निष्कर्षण

  1. आरएनए गिरावट से बचने के लिए आरएनएसई परिशोधन स्प्रे का उपयोग करके एक साफ क्षेत्र तैयार करें। आरएनए प्रक्रियाओं के लिए आरक्षित पिपेट के एक सेट का उपयोग करें। नियोजित सभी ट्यूब और युक्तियां RNase मुक्त होनी चाहिए।
  2. परिपक्व एडिपोसाइट निलंबन (धारा 2.14) को 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं यदि इसे -80 डिग्री सेल्सियस तक संग्रहीत किया गया था।
    नोट: कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें।
  3. एसिड-गुआनिडिनियम-फिनोल आधारित अभिकर्मक के 1,000 माइक्रोन जोड़कर लाइसे कोशिकाएं, और समरूप बनाने के लिए पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. न्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों के पृथक्करण को बढ़ावा देने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. आरटी पर 12,000 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र सेल लाइसेट। तीन चरण प्राप्त किए जाएंगे: एडिपोसाइट लिपिड के अनुरूप एक ऊपरी चरण (पीला), न्यूक्लिक एसिड के अनुरूप एक मध्य चरण (गुलाबी), और एक गोली (सेलुलर मलबे)।
  6. ध्यान से लिपिड परत को हटा दें, एक P200 माइक्रोपिपेट का उपयोग कर.
  7. मध्य चरण को एक नई 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, लिपिड अवशेष और गोली परेशान (लगभग 700 माइक्रोन) से बचें।

4. माइक्रोआरएनए सहित कुल आरएनए का शुद्धिकरण

नोट: एक स्तंभ आधारित कुल शाही सेना शुद्धि विधि उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. धारा 3.7, लगभग 700 माइक्रोन से नमूने में इथेनॉल (95% -100%) की बराबर मात्रा जोड़ें, और 10 एस के लिए ट्यूब को उलटकर हाथ से मिलाएं।
  2. मिश्रण के 700 माइक्रोन को एक संग्रह ट्यूब, अपकेंद्रित्र में डाले गए कॉलम में स्थानांतरित करें और प्रवाह-थ्रू को त्याग दें।
  3. स्तंभ पुनः लोड करें और चरण 4.2 दोहराएँ.
  4. कॉलम को एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कॉलम और अपकेंद्रित्र में प्री-वॉश बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और इस चरण को दोहराएँ.
  6. 2 मिन के लिए कॉलम और अपकेंद्रित्र में वॉश बफर के 700 माइक्रोन जोड़ें।
  7. कॉलम को ध्यान से न्यूक्लियस मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. कॉलम मैट्रिक्स में सीधे न्यूक्लिज-मुक्त पानी के 50 माइक्रोन जोड़ें और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आरएनए को एल्यूट करें। 200 माइक्रोन माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके 10 माइक्रोन के एलिकोट तैयार करें।
  9. तुरंत बर्फ पर aliquots डाल दिया और शाही सेना एकाग्रता और शुद्धता निर्धारित करने के लिए उनमें से एक का उपयोग करें.
  10. आरएनए अखंडता और माइक्रोआरएनए एकाग्रता को मापने के लिए 100 एनजी/माइक्रोन में समायोजित कुल आरएनए के 5 माइक्रोन का विभाज्य तैयार करें।
  11. उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. परिपक्व एडिपोसाइट आरएनए एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता का निर्धारण; microRNA मात्रा का ठहराव परख

नोट: आरएनए एकाग्रता और शुद्धता निर्धारण यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके किया जाता है; शाही सेना अखंडता और miRNA मात्रा का ठहराव एक शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषक का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. आणविक ग्रेड पानी के साथ नमूना पाठक धो लें और पोंछ.
  2. क्षालन पानी (रिक्त) के 2 माइक्रोन लोड करें, सेटिंग को आरएनए में बदलें, और रिक्त बटन पर क्लिक करें ।
  3. नमूना के 2 माइक्रोन लोड करें और माप बटन पर क्लिक करें।
  4. पढ़ने के पूरा होने के बाद, A260/A280 और A260/A230 अनुपात के साथ-साथ आरएनए (एनजी/μL)(चित्रा 1ए)की मात्रा रिकॉर्ड करें।
    नोट: 2.0 के आसपास OD260/OD280 और OD260/OD230 अनुपात के साथ RNA को शुद्ध माना जाता है।
  5. निर्माता के निर्देशों (चित्रा 1 बी) का पालन करते हुए आरएनए अखंडता किट का उपयोग करके आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) को मापें।
    नोट: एक रिन = 10 बरकरार आरएनए से मेल खाती है, जबकि एक आरआईएन ≤ 3.0 एक दृढ़ता से अपमानित आरएनए को इंगित करता है। अभिव्यक्ति माइक्रोएरे या आरटी-क्यूपीसीआर के लिए, आरआईएन ≥ 6.0 के साथ आरएनए का उपयोग करें।
  6. निर्माता के निर्देशों (चित्रा 1 सी) का पालन करते हुए, माइक्रोआरएनए की एकाग्रता और प्रतिशत निर्धारित करने के लिए एक छोटे आरएनए किट का उपयोग करें।
    नोट: छोटे और सूक्ष्म आरएनए के overestimation से बचने के लिए, आरआईएन ≥ 6.0 के साथ शाही सेना के नमूने का उपयोग करें.

6. स्ट्रोमल संवहनी अंश कोशिकाओं की गणना और व्यवहार्यता

  1. एसवीएफ सेल निलंबन (धारा 2.24) के 10 माइक्रोन को 0.4% ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन (अंतिम कमजोर पड़ने 1:10) के 90 माइक्रोन में पतला करें और एक मानक हेमोसाइटोमीटर पर 10 माइक्रोन लागू करें।
  2. गिनती कक्ष के कोने पर चार वर्गों में, मृत कोशिकाओं को छोड़कर, ध्यान से व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना.
  3. मूल निलंबन में मौजूद सेल एकाग्रता का निर्धारण करें: सेल एकाग्रता = कुल सेल गिनती/4 एक्स कमजोर पड़ने कारक (10) x 10,000 = कोशिकाओं/एमएल
  4. प्राप्त सेलुलर उपज (ऊतक के प्रति ग्राम कोशिकाओं) की गणना करने के लिए, मूल कुल नमूना मात्रा (एमएल में) द्वारा सेलुलर एकाग्रता गुणा और ऊतक पचाने के वजन से विभाजित (ग्राम में)।
  5. जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन निम्नानुसार करें: % व्यवहार्यता = (व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या / कोशिकाओं की कुल संख्या) x 100।

7. स्ट्रोमल संवहनी अंश से मैक्रोफेज सबसेट की विशेषता

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री और पेलेट कोशिकाओं के लिए कुल 1 x 106 एसवीएफ कोशिकाओं/एमएल को 5 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. भंवर ध्यान से गोली ढीला और आरटी पर 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए।
  3. सेल सतह एंटीजन के लिए विशिष्ट प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पूर्व-शीर्षक वाली इष्टतम एकाग्रता जोड़ें; धीरे मिश्रण और आरटी पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. ठंड 1x पीबीएस (≈ 1 एमएल) की अधिकता जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर एसवीएफ को अपकेंद्रित्र करें।
  5. तेजी से decantation द्वारा supernatants त्यागें. सावधान रहें कि गोली को परेशान न करें।
  6. 1x lysing समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट सेते हैं, सीधे प्रकाश से ट्यूबों की रक्षा.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के बाद समाधान निकालें, और डेटा अधिग्रहण तक अंधेरे में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. भंवर कोशिकाओं को अच्छी तरह से कम गति पर प्राप्त करने से पहले एकत्रीकरण को कम करने के लिए.
  9. आरटी पर म्यान तरल पदार्थ के 5 एमएल में एसवीएफ गोली को फिर से निलंबित करें, और बाद में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण से पहले एक नए 5 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब में धुंध की तीन परतों के माध्यम से फ़िल्टर करें, ताकि सेल सॉर्टर लाइनों को रोकना कम हो सके।
  10. भंवर प्रत्येक ट्यूब विश्लेषण से पहले संक्षेप में.
  11. ब्याज के नमूनों से डेटा प्राप्त करें। प्रवाह विश्लेषण के लिए, कम से कम 10,000 घटनाओं की गणना करें।
    नोट: यदि सेल सॉर्टिंग फ्लो साइटोमीटर का उपयोग कर रहे हैं, तो बाद के अध्ययनों में आवेदन के लिए मैक्रोफेज को अलग करें।

8. गेटिंग रणनीति

  1. सिंगलेट जनसंख्या(चित्रा 2ए)का निर्धारण करने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) के क्षेत्र के खिलाफ ऊंचाई या चौड़ाई प्लॉट करें।
  2. एफएससी के खिलाफ साइड स्कैटर (एसएससी) के लिए क्षेत्र की साजिश रचने वाली कोशिकाओं का चयन करें, सेलुलर मलबे (चित्रा 2बी)को त्यागना।
  3. चयनित कोशिकाओं से, सीडी 45 को हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं(चित्रा 2सी)और सीडी45/सीडी14 डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को मैक्रोफेज(चित्रा 2डी)के रूप में व्यक्त करने वाली आबादी की पहचान करें।
  4. सीडी 45 + / सीडी 14 + मैक्रोफेज से, नकारात्मक और सकारात्मक एचएलए-डीआर कोशिकाओं (चित्रा 2ई) का पता लगाएं।
    नोट: एंटीबॉडी पैनल के लिए मुआवजा नियंत्रण शामिल करें और पैनल के लिए पर्याप्त बहुरंगा प्रवाह साइटोमीटर पर वर्णक्रमीय ओवरलैप समायोजित करें। हम तीन लेज़रों (405 एनएम वायलेट लेजर, 488 एनएम ब्लू लेजर, और 640 एनएम लाल लेजर) से लैस साइटोमीटर का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करते हैं, और संकेतित फ्लोरोक्रोम के लिए डिटेक्टर।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल आंशिक ओमेंटेक्टॉमी के बाद स्वस्थ गर्भवती महिलाओं से प्राप्त वैट बायोप्सी से एक एकल प्रक्रिया में, व्यवहार्य परिपक्व एडिपोसाइट्स और एसवीएफ कोशिकाओं को अलग करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कोलेजेनेज पाचन का उपयोग करके एक एंजाइमेटिक विधि का वर्णन करता है। इस मामले में, हम आरएनए निष्कर्षण के लिए एडिपोसाइट्स और मैक्रोफेज फेनोटाइपिंग के लिए एसवीएफ का उपयोग करते हैं।

आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल एक पर्याप्त शुद्धता, उच्च अखंडता, और परिपक्व आदिपोसाइट्स (चित्रा 1) से माइक्रोआरएनए प्राप्त करने में सक्षम है। आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषक द्वारा मूल्यांकन की गई आरएनए अखंडता के परिणामस्वरूप प्रोटोकॉल (आरआईएन = 9.7) के साथ पृथक एडिपोसाइट्स के नमूनों के लिए उत्कृष्ट मूल्य प्राप्त हुए।

वैट-एसवीएफ में मौजूद न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं की कुल संख्या लगभग 2.8 x 106 कोशिकाओं/ग्राम वैट (2.8 x 106 ± 1.7 x 106) थी, जिसमें 64% व्यवहार्यता (63.9 ± 2.0) ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परीक्षण का उपयोग किया गया था। एसवीएफ कोशिकाओं को फ्लोरोफोरे-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था ताकि प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग विश्लेषण द्वारा एटी मैक्रोफेज की पहचान और विशेषता हो सके। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सेलुलर मार्करों (चित्रा 2) के आधार पर विभिन्न सेल आबादी दिखा भूखंडों उत्पन्न. प्रारंभ में, फॉरवर्ड स्कैटर-क्षेत्र (एफएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर-ऊंचाई (एफएससी-एच) की साजिश रचकर, सेल समुच्चय आसानी से विश्लेषण(चित्रा 2ए)से समाप्त हो गए थे। फिर, सेलुलर मलबे को फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर-एरिया (एसएससी-ए)(चित्रा 2बी)का उपयोग करके सही आकार और जटिलता के आधार पर कोशिकाओं को गेटिंग करके बाहर रखा गया था। अगला, मैक्रोफेज का विश्लेषण करने के लिए, अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बाहर करना आवश्यक नहीं था। सबसे पहले, मोनोसाइट / मैक्रोफेज वंश कोशिकाओं को सीडी 45 और सीडी 14 मार्करों (चित्रा 2सी, डी) के उपयोग से चुना गया था। इसके बाद, सीडी 45/सीडी 14 डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को मैक्रोफेज मार्कर एचएलए-डीआर अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया गया, जहां दो सबसेट मैक्रोफेज की पहचान की गई: एचएलए-डीआर- और एचएलए-डीआर + (चित्रा 2ई)।

Figure 1
चित्रा 1: परिपक्व आदिपोसाइट्स से आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण। (ए) आरएनए एकाग्रता, 260/280, और 260/230 अनुपात; (बी) अखंडता विश्लेषण। इलेक्ट्रोफेरोग्राम, जेल छवि, और आरएनए अखंडता संख्या एक आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषक और एक आरएनए विश्लेषक किट का उपयोग करके प्राप्त की गई थी; (सी) माइक्रोआरएनए मात्रा का ठहराव। इलेक्ट्रोफेरोग्राम, जेल छवि, और माइक्रोआरएनए प्रतिशत एक आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषक और एक छोटे आरएनए किट का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आंत वसा ऊतक से मैक्रोफेज की पहचान। स्ट्रोमल संवहनी अंश मैक्रोफेज के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों को कोलेजन पाचन का उपयोग करके सिजेरियन सेक्शन के दौरान एकत्र किए गए आंत के वसा ऊतक से अलग किया जाता है। (ए) डबल्स को हटाने के लिए पहले फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए) बनाम एफएससी-ऊंचाई (एफएससी-एच) गेट का उपयोग करके सिंगलेट्स की पहचान। (ख) आकार और घनत्व के आधार पर मलबे को समाप्त करने के लिए एक दूसरे फारवर्ड स्कैटर क्षेत्र (एफएससी-ए) बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (एसएससी-ए) गेट का उपयोग किया गया था। (सी, डी) एसएससी-ए बनाम सीडी 45 गेट ने हेमटोपोइएटिक मूल से कोशिकाओं की पहचान की, और एसएससी-ए बनाम सीडी 14 गेट ने मैक्रोफेज की पहचान की। (ई) एचएलए-डीआर मार्कर के आधार पर कुल सीडी 45 + / सीडी 14 + मैक्रोफेज को गेट किया गया था और मैक्रोफेज के दो सबसेट की पहचान की गई थी: एचएलए-डीआर- और एचएलए-डीआर +। भूखंड व्यक्तिगत विषयों से प्रतिनिधि डेटा का वर्णन करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वैट चयापचय विनियमन और सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मोटापे से जुड़ी पुरानी सूजन में एडिपोसाइट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका में बढ़ती रुचि ने एटी में मौजूद एसवीएफ और वसा कोशिकाओं को अलग करने के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास किया है। हालांकि, अधिकांश तकनीकें एक ही प्रक्रिया में एक ही वैट बायोप्सी से डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं के इन दो अलग-अलग सेटों को प्राप्त करने की अनुमति नहीं देती हैं, जो एडिपोसाइट्स और एसवीएफ कोशिकाओं के बीच बातचीत के संबंध में अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हो सकती हैं। इसलिए, हमने इस प्रोटोकॉल को लागू किया जो वैट बायोप्सी में मौजूद व्यवहार्य परिपक्व एडिपोसाइट्स और एसवीएफ कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है। यह ऊतक पाचन और कोलेजनेज एकाग्रता के समय में पिछली रिपोर्टों से अलग है, साथ ही सेल पृथक्करण के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का समय और गति, पर्याप्त एडिपोसाइट आरएनए पैदावार और विस्तृत मैक्रोफेज सबसेट लक्षण वर्णन को सक्षम करता है।

एटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमी अलगाव तकनीकों की एक बड़ी मात्रा प्रस्तावित की गई है, जैविक विशेषताओं और पृथक कोशिकाओं 17,21,22,23,24के कार्यात्मक गुणों पर विभिन्न प्रभावों के साथ, इसलिए लक्ष्य के अनुसार सबसे उपयुक्त रणनीति चुनना आवश्यक है पीछा किया। अक्सर, वसा ऊतक से परिपक्व आदिपोसाइट्स और एसवीएफ अलगाव ऊतक पृथक्करण एंजाइम 25,26,27का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। हालांकि विभिन्न एंजाइमों एटी अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कोलेजन के साथ एंजाइमी पाचन इस ऊतक27,28को पचाने के लिए सोने के मानक के रूप में रहता है. चूंकि वैट एक नरम मैट्रिक्स से बना है, इसलिए इसे कोलेजनेज टाइप II के साथ आसानी से पचाया जा सकता है। यह प्रक्रिया अनुचित ऊतक पृथक्करण से बचा जाता है क्योंकि यह एंजाइम बाह्य मैट्रिक्स देशी कोलेजन को बाधित करता है, रेशेदार स्ट्रोमा से कई और कोशिकाओं को जारी करता है, सेल व्यवहार्यता, सेल उपज और क्लस्टर भेदभाव अभिव्यक्ति 19,27,28,29पर नगण्य प्रभाव के साथ।

एंजाइमी पाचन के संदर्भ में, एंजाइम एकाग्रता, पाचन अवधि के साथ-साथ वैट से परिपक्व एडिपोसाइट और एसवीएफ सेल अलगाव के लिए एक उचित प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन मापदंडों पर विचार करना भी आवश्यक है क्योंकि ये कारक सेल फेनोटाइप, रिकवरी और अंतिम सेल निलंबन27,29 में व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं. प्रोटियोलिटिक एंजाइम के रूप में कोलेजेनेज का उपयोग कम एकाग्रता [रेंज 0.075% 0.3% (डब्ल्यू / वी)] पर आदर्श है, 2 घंटे से कम की इनक्यूबेशन अवधि के साथ, इसलिए फेनोटाइपिक और कार्यात्मक एसवीएफ विशेषताओं जैसे प्रसार दर, भेदभाव क्षमता, और विशिष्ट सेलुलर वंश की आवृत्ति,30,31 अपरिवर्तित रहती है। हम 60 मिनट और 0.25% कोलेजन की अधिकतम पाचन अवधि का उपयोग करते हैं, सेलुलर व्यवहार्यता और एसवीएफ कोशिकाओं की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति पर एक नगण्य प्रभाव प्राप्त करने के लिए कोलेजन एक्सपोजर की एकाग्रता और लंबाई को कम करते हैं, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में तिरछे परिणामों से बचते हैं। हम वसा कोशिका पृथक्करण के दौरान सेल रिकवरी में सुधार करने के लिए कोमल सेंट्रीफ्यूजेशन कदम और 200 ग्राम/5 मिनट के छोटे सेंट्रीफ्यूजेशन समय भी शामिल करते हैं, प्रोटोकॉल के लिए एक लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि लंबी और तीव्र सेंट्रीफ्यूजेशन अवधि [400 ग्राम/1 मिनट से ऊपर] आदिपोसाइट्स की मृत्यु में वृद्धि होती है, सेलुलर उपज 32,33,34 को सीमित करती है. कोलेजनेज आधारित पाचन प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त एसवीएफ सेलुलर रिकवरी साहित्य में रिपोर्ट की गई 2-6 x 106 कोशिकाओं/जी एटी की विशिष्ट पैदावार के समान है, जबकि 63.9 ± 2.0 की एसवीएफ व्यवहार्यता इन प्रकार की कोशिकाओं 35,36,37,38 के लिए 70% -80% की न्यूनतम प्रस्तावित सीमा से मामूली कम है. यह संभावना है क्योंकि हम मानक प्रोटोकॉल के रूप में एसवीएफ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए संस्कृति मीडिया का उपयोग नहीं करते हैं, क्योंकि हम उनकी सतह मार्करों के माध्यम से मैक्रोफेज आबादी को चिह्नित करते हैं, और यह बताया गया है कि ये कोशिकाएं पर्यावरणीय परिस्थितियों के जवाब में उल्लेखनीय प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करती हैं, यहां तक कि उनके फेनोटाइप 39,40,41को भी बदल रही हैं।

इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करना भी महत्वपूर्ण है कि वैट दाताओं के रूप में इस प्रोटोकॉल में शामिल गर्भवती महिलाएं स्वस्थ थीं, चयापचय सहरुग्णता का कोई नैदानिक प्रमाण नहीं था, गर्भावस्था के दौरान सामान्य वजन, औसत आयु 20-25 वर्ष, और सामान्य प्रीस्टेशनल बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई 18.5-24.9 किग्रा / एन = 7), क्योंकि कुछ लेखकों ने वर्णन किया है कि विभिन्न दाताओं, आयु, बीएमआई और लिंग या जातीयता का सेल नंबर पर प्रभाव पड़ता है, और एसएफवी सतह मार्करों की अभिव्यक्ति 42,43,44।

दूसरी ओर, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल विश्लेषण बरकरार शाही सेना की उचित मात्रा की आवश्यकता है, लेकिन परिपक्व adipocytes से अपने अलगाव विशेष रूप से मुश्किल है क्योंकि इन कोशिकाओं एक उच्च लिपिड सामग्री है और कुछ मामलों में, सेल संख्याकम 45,46,47,48 है. हमने एक मानक गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट/फिनोल विधि 49,50के आधार पर परिपक्व आदिपोसाइट्स से एक आरएनए अलगाव प्रक्रिया को अनुकूलित किया, जो लिपिड और सेलुलर मलबे को खत्म करने में सक्षम बनाने वाले आसान चरणों को लागू करता है। नमूना तैयार करने के बाद, कॉलम-आधारित आरएनए निष्कर्षण हमें माइक्रोआरएनए सहित एक उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए मुक्त आरएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो एटी नमूनों के लिए काफी असामान्य है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषक के माध्यम से इन आरएनए की शुद्धता और अखंडता सत्यापन यह सुनिश्चित करता है कि पृथक आरएनए गुणवत्ता आरटी-क्यूपीसीआर परख और अभिव्यक्ति माइक्रोएरे जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

पहले वर्णित लाभों के अलावा, कोलेजन का उपयोग करके एटी पाचन एक साथ एडिपोसाइट्स और निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मुक्त करने की अनुमति देता है, सेल सतह रिसेप्टर्स की अखंडता को बनाए रखता है; विश्वसनीय और व्याख्यात्मक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा27 प्राप्त करने के लिए एसवीएफ सेल अलगाव के दौरान यह एक महत्वपूर्ण तथ्य है। इसके अतिरिक्त, वैट जैसे लिपिड से लदी ऊतकों से अलग कोशिकाओं को एकत्रीकरण के लिए अधिक प्रवण होने, क्रमबद्ध सेल उपज को कम करने, और autofluorescence51 में वृद्धि. प्रोटोकॉल में, छँटाई से पहले धुंध की तीन परतों के माध्यम से निस्पंदन द्वारा इन सेल समुच्चय का उन्मूलन और वर्णित गेटिंग रणनीति के साथ उनके बहिष्करण, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने, सेल छँटाई के लिए नमूना गुणवत्ता में सुधार.

पिछले अध्ययन इन कोशिकाओं 52,53,54,55,56,57,58,59 के लिए सीडी मार्करों की विशेषता का एक सेट का उपयोग कर SVF में मौजूद कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आयोजित किया गया है. वैट एसवीएफ में मैक्रोफेज उपप्रकारों के अधिक गहन लक्षण वर्णन के लिए, हमने इन कोशिकाओं को विशिष्ट सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा वर्गीकृत किया। वैट 45 में मोनोसाइट/मैक्रोफेज लाइनेज कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली सीडी14 और सीडी 60 मार्कर अभिव्यक्ति के अनुसार, हमने पाया कि यह ऊतक हेमटोपोइएटिक मूल से एक विशिष्ट सीडी 45 + सीडी 14 + मैक्रोफेज आबादी से बना है। एक ही प्रोटोकॉल का प्रयोग, एक पिछले अध्ययन में हम एम 1 (सीडी 11 सी) और एम 2 (सीडी 163 और सीडी 206) मैक्रोफेज आबादी20 चिह्नित करने में सक्षम थे.

एटी के भीतर मैक्रोफेज फेनोटाइपिंग को प्रो-इंफ्लेमेटरी मैक्रोफेज (शास्त्रीय रूप से सक्रिय-एम 1) से एंटी-इंफ्लेमेटरी मैक्रोफेज (वैकल्पिक रूप से सक्रिय-एम 2) तक एक स्पेक्ट्रम के रूप में वर्गीकृत किया गया है, इसकी सतह 61,62पर विभिन्न सक्रियण मार्करों की उपस्थिति के अनुसार। एचएलए-डीआर मैक्रोफेज मार्कर मैक्रोफेज सक्रियण डिग्री63,64को दर्शाता है, और एम 1 या एम 2 फेनोटाइप स्थापित करने के लिए प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था: एचएलए-डीआर + व्यक्त मैक्रोफेज आबादी भड़काऊ है और एचएलए-डीआर- गैर-भड़काऊ मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसलिए, एचएलए-डीआर मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर, मैक्रोफेज के दो सबसेट परिभाषित किए गए थे: सीडी 45 + सीडी 14 + एचएलए-डीआर- और सीडी 45 + सीडी 14 + एचएलए-डीआर +, जो मोनोसाइट्स को प्रसारित करने से उत्पन्न होते हैं और वसा ऊतक 65,66के भीतर मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के रूप में जाना जाता है।

इसके अतिरिक्त, हमने प्रत्येक मैक्रोफेज उपप्रकार पर CD11c (M1 मार्कर), साथ ही CD163 और CD206 (M2 मार्कर) की मात्रा निर्धारित की, यह निर्धारित करते हुए कि AT मैक्रोफेज अपनी झिल्ली की सतह पर सभी मूल्यांकन किए गए सक्रियण मार्करों को प्रदर्शित करते हैं, यह दर्शाता है कि गर्भवती महिलाओं से वैट में मौजूद मैक्रोफेज में M1 और M2 मैक्रोफेज आबादी के अत्यधिक सरलीकृत वर्गीकरण के लिए वर्णित लोगों की तुलना में अधिक जटिल विशेषताएं हैं। इसलिए, मल्टीकलर एंटीबॉडी पैनल और कड़े सेल गेटिंग के साथ बुनियादी प्रवाह साइटोमेट्री को लागू करने से एसवीएफ में कोशिकाओं के विषम पूल से मैक्रोफेज की पहचान और विशेषता संभव हो जाती है। प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिष्कृत मैक्रोफेज फेनोटाइपिंग एटी में मैक्रोफेज आबादी के गतिशील परिवर्तनों को स्पष्ट करने के लिए किए गए अध्ययनों में उपयोगी हो सकती है जो एटी होमियोस्टेसिस में गड़बड़ी का कारण बनती है।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल को वैट मैक्रोफेज को चिह्नित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, एंटीबॉडी पैनल में किए गए समायोजन एटी में रहने वाले अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छंटाई की सुविधा के लिए अपने अनुप्रयोगों का विस्तार कर सकते हैं, क्योंकि विभिन्न वंश के विशिष्ट मार्करों की पहचान करने के लिए कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। इसके अलावा, विधि सेल छँटाई द्वारा शुद्ध सेल आबादी डीएनए / आरएनए/प्रोटीन निष्कर्षण या पूर्व विवो उपचार के रूप में बाद तरह विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अनुमति देता है, बाँझपन तकनीक के साथ एक उपयुक्त मीडिया में सीधे कोशिकाओं को प्राप्त.

संक्षेप में, हम मानते हैं कि यहां विस्तृत प्रोटोकॉल समय, संसाधनों, सेलुलर उपज और सेल व्यवहार्यता के बीच सबसे कुशल व्यापार का प्रतिनिधित्व करता है, इसके अलावा वसा कोशिकाओं से आरएनए और एमआईआरएनए निष्कर्षण के लिए अत्यधिक कुशल है, और एटी में मैक्रोफेज आबादी के लक्षण वर्णन के लिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को Instituto Nacional de Perinatologia (अनुदान संख्या: 3300-11402-01-575-17 और 212250-3210-21002-06-15) और CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (अनुदान संख्या 2015-3-2-61661) से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes Corning CLS4101-50EA Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-L-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-R-S RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip Axygen T-1000-B-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip Axygen T-200-Y-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA -
2101 Bioanalyzer PC Agilent G2953CA 2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube Corning 352003  Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes Corning CLS430828-100EA Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent Zymo Research R2050-1-200 TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 -
Agilent Small RNA Kit Agilent 5067-1548 -
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody BioLegend 325620 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker - - 250 ml, non sterile
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912-100G Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station Agilent 5065-9951 -
Collagenase type II Gibco 17101-015 Powder
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G Powder
Direct-zol RNA Miniprep Zymo Research R2051 Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps - - Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray - - Stainless steel
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023-500ML 200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid BD Biosciences 342003 -
FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202 -
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter BD Biosciences 648282 -
FASCDiva Software BD Biosciences 642868 Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer Sigma Z359629-1EA -
Manual cell counter - - -
Mayo dissecting scisors - - Stainless steel
Microcentrifuge - - Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND2000LAPTOP -
Orbital shaker - - Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642040 1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642090 100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642010 0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642080 20 to 200 μL
PCR tube storage rack Axygen R96PCRFSP -
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307608 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody BioLegend 304016 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P3813-10PAK Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller - - -
Red Blood Cells Lysis Buffer Roche 11 814 389 001 For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge - - Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container - - -
Transfer pipette Thermo Scientific-Samco 204-1S Sterile
Trypan Blue Gibco 15250-061 0.4% Solution
Tube racks - - For different tube sizes
Vortex Mini Shaker Cientifica SENNA BV101 -

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References

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