Una guida passo-passo all'elettroantennography delle zanzare
Summary
Il presente articolo descrive un protocollo passo-passo per elettroantennogrammi di successo e a basso rumore in diversi generi di zanzare, comprese sia femmine che maschi.
Abstract
Le zanzare femmine sono gli animali più letali sulla terra, rivendicando la vita di oltre 1 milione di persone ogni anno a causa di agenti patogeni che trasmettono quando acquisiscono un pasto di sangue. Per individuare un ospite di cui nutrirsi, le zanzare si affidano a una vasta gamma di segnali sensoriali, tra cui visivi, meccanici, termici e olfattivi. Lo studio descrive una tecnica, l’elettroantennography (EAG), che consente ai ricercatori di valutare se le zanzare possono rilevare singole sostanze chimiche e miscele di sostanze chimiche in modo dipendente dalla concentrazione. Se accoppiata con la gascromatografia (GC-EAG), questa tecnica consente di esporre le antenne a uno spazio di testa completo / miscela complessa e determina quali sostanze chimiche presenti nel campione di interesse, la zanzara può rilevare. Questo è applicabile agli odori del corpo ospite, nonché ai bouquet floreali delle piante o ad altri odori ecologicamente rilevanti (ad esempio, odori dei siti di ovideposizione). Qui, abbiamo descritto un protocollo che consente lunghe durate di tempo di risposta alla preparazione ed è applicabile sia alle zanzare femmine che ai maschi di più generi, tra cui le zanzare Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Poiché l’olfatto gioca un ruolo importante nelle interazioni zanzara-ospite e nella biologia delle zanzare in generale, EAG e GC-EAG possono rivelare composti di interesse per lo sviluppo di nuove strategie di controllo dei vettori di malattia (ad esempio, esche). Integrato con saggi comportamentali, è possibile determinare la valenza (ad esempio, attrattivo, repellente) di ciascuna sostanza chimica.
Introduction
Le zanzare sono gli organismi più letali sulla terra, reclamano la vita di oltre un milione di persone all’anno e mettono più della metà della popolazione mondiale a rischio di esposizione agli agenti patogeni che trasmettono, mentre mordono1. Questi insetti si basano su una vasta gamma di segnali (termici, visivi, meccanici, olfattivi, uditivi) per individuare un ospite di cui nutrirsi (sia vegetale che animale), per l’accoppiamento e l’ovideposizione, nonché per evitare i predatori sia allo stadio larvale che a quello adulto 2,3. Tra questi sensi, l’olfatto gioca un ruolo critico nei comportamenti sopra menzionati, in particolare per la rilevazione a medio-lungo raggio di molecole odoranti 2,3. Gli odori emessi da un ospite o da un sito di ovideposizione sono rilevati da vari recettori olfattivi specifici (ad esempio, GR, OR, IR) situati sulla proboscide dei palpi di zanzara, tarsi e antenne 2,3.
Poiché l’olfatto è una componente chiave dei loro comportamenti di ricerca dell’ospite (piante e animali), accoppiamento e ovideposizione, costituisce quindi un obiettivo ideale da studiare per sviluppare nuovi strumenti per il controllo delle zanzare4. La ricerca su repellenti (ad esempio, DEET, IR3535, picaridina) ed esche (ad esempio, BG sentinella human lesca) è estremamente prolifica5, ma a causa delle attuali sfide nel controllo delle zanzare (ad esempio, resistenza agli insetticidi, specie invasive), è essenziale sviluppare nuovi metodi di controllo efficienti informati dalla biologia delle zanzare.
Molte tecniche (ad esempio, olfattometro, saggi di atterraggio, elettrofisiologia) sono state utilizzate per valutare la bioattività di composti o miscele di composti nelle zanzare. Tra questi, l’elettroantennography (o elettroantennogrammi (EAG)) può essere utilizzata per determinare se gli odori vengono rilevati dalle antenne delle zanzare. Questa tecnica è stata inizialmente sviluppata da Schneider6 ed è stata utilizzata in molti generi di insetti diversi da allora, tra cui falene 7,8,9, bombi 10,11, api 12,13 e moscerini della frutta 14,15 per citarne alcuni. L’elettroantennography è stata anche impiegata utilizzando vari protocolli, tra cui antenne singole o multiple nelle zanzare 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Le zanzare sono insetti relativamente piccoli e delicati con antenne piuttosto sottili. Mentre eseguire EAG su insetti più grandi come falene o bombi è relativamente facile a causa delle loro dimensioni maggiori e antenne più spesse, condurre EAG nelle zanzare può essere difficile. In particolare, il mantenimento di un buon rapporto segnale-rumore e una preparazione reattiva duratura sono due requisiti principali per la riproducibilità e l’affidabilità dei dati.
La guida passo-passo agli EAG a basso rumore qui proposta offre direttamente soluzioni a queste limitazioni e rende questo protocollo applicabile a diverse specie di zanzare di vari generi, tra cui Aedes, Anopheles, Culex e Toxorhynchites, e descrive la tecnica sia per le femmine che per i maschi. L’elettroantennography offre un modo rapido ma affidabile per esaminare e determinare composti bioattivi che possono quindi essere sfruttati nello sviluppo di esche dopo che la valenza è stata determinata con saggi comportamentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I comportamenti mediati dall’olfatto sono influenzati da molti fattori, tra cui fisiologici (ad esempio, età, ora del giorno) e ambientali (ad esempio, temperatura, umidità relativa)30. Pertanto, quando si eseguono EAG, è essenziale utilizzare insetti che si trovano nello stesso stato fisiologico (ad esempio, monitoraggio dell’età, fame, accoppiamento)31 e mantenere anche un ambiente caldo e umido intorno alla preparazione per evitare l’essiccazione. Una temperatura int…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sono grato al Dr. Clément Vinauger e al Dr. Jeffrey Riffell per le utili discussioni. I seguenti reagenti sono stati ottenuti tramite BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Ceppo STE2, MRA-128, contributo di Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contributo di David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Ceppo JHB, Uova, NR-43025. L’autore ringrazia il Dr. Jake Tu, il Dr. Nisha Duggal, il Dr. James Weger e Jeffrey Marano per aver fornito uova di zanzara Culex quinquefasciatus e Anopheles stephensi (ceppo: Liston). Aedes albopictus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis derivano da zanzare campestri raccolte dall’autore nell’area di New River Valley (VA, USA). Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biochimica e dal Fralin Life Science Institute.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Referências
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito’s sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. . The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
